论文部分内容阅读
目的：胆石症（cholelithiasis）的病因包括胆汁代谢异常和感染。在致石性胆汁研究中，胆汁中胆汁酸含量减少是促石形成的重要因素。胆盐输出泵（Bile Salt Export Pump，BSEP）是调节胆汁酸排泄的关键转运体，其表达量下降将导致胆汁酸分泌减少、胆汁淤积。而AMPK调节BSEP的表达，受机体代谢因素的影响。瘦素（Leptin）是机体调节能量代谢的激素之一，可通过AMPK调节机体能量代谢。本实验观察肝脏良性病变患者、胆囊固醇结石患者、原发性肝内胆管结石患者Leptin、AMPKα2、BSEP的mRNA和蛋白表达量，Leptin/AMPKα2/BSEP信号通路对胆汁酸代谢的调控，初步探讨胆石症患者中胆汁酸代谢调控机制，丰富胆石症的发病机理。对象与方法：1、研究对象共分为3组，胆囊结石（Gall Stone,GS）组共30例，原发性肝内胆管结石（Primary intrahepatic stone,PIS）组共30例，肝脏良性病变（Control,CT）组，该组患者中均无合并胆道疾病，其中肝血管瘤8例，肝囊肿5例，肝外伤2例，共计15例。血清样本的获得：抽取患者术前空腹血清，采用放免法检测血清瘦素水平，运用全自动生化分析仪检测血清中总胆汁酸（Total Bile acid，TBA）、总胆红素(Total bilirubin,TBIL)、直接胆红素(Directbilirubin,DBIL)、间接胆红素(Indirect bilirubin,IBIL)、总胆固醇(Totalcholesterol,TC)、甘油三酯(Triglycerides,TG)、丙氨酸转氨酶(Alanineaminotransferase,ALT)、谷草转氨酶（Aspertate aminotransferase，AST）。肝组织样本的获得：经伦理委员会审批授权，患方知情同意后，采集手术中切下肝组织后，立即切除适当大小装入预装RNA保存液的冻存管中，送泸州医学院附属医院中心实验室-80℃冰箱冻存。2、采用Real-time Quantitative PCR方法,以GAPDH为内参照，检测肝组织中OB-Rb、AMPKα2、BSEP基因mRNA的表达量。OB-RB5’primer：GCCTTCATAAGCCTACCAATGTAGA，OB-Rb5’Reverser：GGAAACAAGGGACCTTCCCACTA，AMPKα25’primer：CAGGAGATGCAGTCCAGCACAA，AMPKα25’Reverser：5’GCCCACATCTACCTATCACATTCAG，BSEP5’primer：TCGCTTGTCCACCATCCAGAA，BSEP5’Reverser：GGGGATCCAGTGGTGACTAGTT。根据标准曲线和样本PCR反应Ct值，用Bio-Rad iQ5软件分析计算目的基因的mRNA表达水平。3、采用Western blot法检测肝组织中OB-Rb、AMPKα2、p-AMPKα2、BSEP蛋白表达水平：以β-actin为内参，抗体1分别选择Anti-LeptinReceptor antibody：ab5593，AMPKα Antibody：2532，Phospho-AMPKα：2535，BSEP Antibody (P-18): sc-17294，检测上述基因所编码蛋白表达量。图像结果使用Bio-Rad凝胶摄像分析系统及Quantity One4.4.0软件分析计算相关蛋白的表达量。计量资料用均数±标准差（xˉ±s）表示，用SPSS20.0软件进行统计学分析。组均数间比较采用析因设计的方差分析，组间两两比较采用最小差异t检验(LSD-t)，若方差不齐，采用Dunnett’s T3检验，组间三者比较采取秩和检验，P <0.05认为差异有统计学意义。结果：1.血清相关指标分析：血清中Leptin在各组中均有一定的变化，同CT组（5.66±4.41μg/L）和PIS组（4.87±3.66μg/L）比较，GS组（8.66±4.4μg/L）血清Leptin水平显著升高，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。然而，同GS组（8.66±4.4μg/L）比较，PIS组（4.87±3.66μg/L）血清Leptin水平显著降低，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。同CT组（4.35±0.84mmol/L，1.51±1.2mmol/L）和PIS组（4.5±1.73mmol/L，1.37±0.88mmol/L）比较，GS组血清总胆固醇（4.74±1.12mmol/L）、甘油三酯（1.96±1.84mmol/L）水平虽有升高趋势，其差异无统计学意义（P＞0.05）。同CT组和GS组比较，PIS组总胆汁酸（20.88±33.25μmol/L）、总胆红素（42.19±59.93μmol/L）、直接胆红素（25.9±45.51μmol/L）、谷丙转氨酶(60.21±57.3U/L)、谷草转氨酶(75.01±79.05U/L)均显著升高，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。2.同CT组（1）比较，GS组（0.857）、PIS组（0.612）OB-Rb基因mRNA表达量显著降低，其差异具有统计学意义（P＜0.05）；同CT组（1）比较，GS组（0.889）、PIS组（0.567）AMPKα2基因mRNA表达量显著降低，其差异具有统计学意义（P＜0.05）；同CT组（1）比较，GS组（0.847）、PIS组（0.687）BSEP基因mRNA表达量显著降低，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。3.同CT组（1±0.67）比较，GS组（0.19±0.08）、PIS（0.14±0.02）组OB-RB基因蛋白表达量显著降低，其差异具有统计学意义（P＜0.05）；同CT组（1±0.83）比较，GS组（0.09±0.38）、PIS组（0.13±0.12）AMPKα2基因蛋白表达量显著降低，其差异具有统计学意义（P＜0.05）；同CT组（8.95±3.29）比较，GS组（1.74±0.52）、PIS组（1.01±0.66）p-AMPKα2基因蛋白表达量显著降低，其差异具有统计学意义（P＜0.05）；同CT组（8.95±3.29）比较，GS组（1.74±0.52）、PIS组（1.01±0.66）BSEP基因蛋白表达量显著降低，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：1.PIS组患者血清TBA、TBIL、DBIL、ALT、AST明显高于GS组和CT组，提示原发性肝内胆管结石患者有胆道梗阻，可能存在胆汁酸排泄障碍。2.GS患者血清瘦素升高，但肝脏组织中OB-Rb以及AMPKα2、p-AMPKα2、BSEP基因的mRNA和蛋白表达下降。提示GS患者存在一定程度的瘦素抵抗，胆石的形成与Leptin/AMPKα2/BSEP有关。3.PIS患者血清瘦素降低伴肝脏瘦素受体下调，并存在肝脏的AMPKα2、p-AMPKα2、BSEP基因的mRNA和蛋白表达下降，出现胆汁酸排泄障碍，胆汁淤积，提示胆石的形成与Leptin功能不能完全发挥有关。因此，Leptin在胆石症的发展过程中具有重要作用，Leptin/AMPKα2/BSEP信号通路可能参与调控了GS，PIS中胆汁酸代谢的调控，在胆石形成的病理生理过程中发挥重要作用。