研究背景:在过去60年间,人类精液质量不断下降,男性不育症患病率不断上升,其中,人类对环境污染物的长期接触和不断摄入是一个很重要的诱因。双酚A(Bisphenol A,BPA)是一种用途广泛的化工原料,同时也是一种典型的环境内分泌干扰物。近年来,随着工业的迅速发展,食品包装、电子产品、建筑、医疗器械等行业对BPA的使用量巨大,BPA在生产过程中的残留以及在使用过程中的溶出会污染水体与食物,从而导致人群普遍暴露于BPA之中。BPA对男性生殖健康的潜在危害引起全球科学家们的高度关注。尽管目前有关BPA对雄性生殖健康影响的报道有很多,但是BPA致雄性生殖损伤的分子机制仍然不十分明确。全面深入研究BPA致雄性生殖毒性效应并探讨其相关的分子机制具有十分重要的现实意义。研究内容:1.BPA致雄性生殖损伤的体内生物学效应评价将32只8周龄SPF级雄性昆明小鼠随机分为4组,采用灌胃的方式使各组小鼠分别暴露于0 mg/kg/d BPA、3 mg/kg/d BPA、30 mg/kg/d BPA和300 mg/kg/d BPA,连续染毒35 d以构建BPA致雄性生殖毒性体内染毒模型。采用计算机辅助精液质量分析系统分析小鼠附睾中精子活力及精子密度;伊红染色观察精子形态,计算精子畸形率;H&E染色观察小鼠睾丸组织病理形态;TUNEL法检测小鼠睾丸组织凋亡情况;透射电子显微镜下观察睾丸组织超微结构。2.BPA染毒小鼠精母细胞全基因组表达谱芯片检测及数据分析以小鼠精母细胞株(GC-2细胞)为染毒对象,分别选用20μM、40μM及80μM BPA染毒48h以构建BPA损伤精母细胞体外染毒模型;光学显微镜下观察各组细胞形态,CCK8法检测各组细胞活力;全基因组表达谱芯片检测由上海其明技术有限公司进行;通过http://enrich.shbio.com/网站对差异表达基因进行富集分析;采用qRT-PCR法对差异明显的基因进行筛选验证。3.XAF1在BPA诱导的生精细胞凋亡中的作用及机制研究采用流式细胞仪检测、超微结构观察以及Western blot法检测BPA处理后GC-2细胞的凋亡情况。通过qRT-PCR法以及Western blot法检测BPA处理后GC-2细胞以及小鼠睾丸组织中XAF1的表达水平;采用siRNA干扰技术构建XAF1干扰细胞模型,并利用流式细胞仪及Western blot法检测XAF1干扰及BPA处理后GC-2细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达情况;ELISA法检测BPA染毒体内外模型中IFNβ的表达水平,并在IFNβ干扰细胞模型基础上采用Western blot法检测BPA处理后细胞中XAF1及XIAP的蛋白表达水平。4.CHCHD10在BPA诱导的生精细胞线粒体损伤中的作用及机制研究采用透射电子显微镜和共聚焦显微镜观察BPA处理后GC-2细胞线粒体超微结构以及线粒体探针标记后的线粒体形态;使用试剂盒检测BPA处理后GC-2细胞内ATP含量及ROS水平;通过siRNA干扰技术构建了CHCHD10干扰细胞模型,并采用ATP检测试剂盒、qRT-PCR法及Western blot法分别检测了BPA处理及CHCHD10干扰后GC-2细胞中ATP含量、线粒体呼吸链及线粒体融合分裂相关基因及蛋白的表达水平;此外,我们还对CHCHD10表达与人群精液参数的相关性进行了分析。研究结果:1.BPA暴露具有潜在的雄性生殖毒性(1)3 mg/kg/d、30 mg/kg/d以及300 mg/kg/d BPA染毒35 d后,各组小鼠生殖系统均出现了不同程度的损伤,并呈一定的剂量-效应关系,说明BPA致雄性生殖毒性体内染毒模型构建成功。其中300 mg/kg/d BPA染毒组小鼠附睾精子活力及精子密度与对照组比较明显下降(P<0.05),不动精子百分比及精子畸形率与对照组比较显著升高(P<0.05)。另外,该剂量组小鼠睾丸组织中各级生精细胞排列紊乱,部分生精细胞缺如,管腔内精子数目减少,部分曲细精管甚至出现变形萎缩,曲细精管中凋亡细胞数目异常增多,精母细胞及精子的线粒体结构明显异常,提示在较高剂量(300 mg/kg/d)暴露条件下BPA具有明显的雄性生殖毒性。(2)30 mg/kg/d是根据人的安全剂量(5 mg/kg/d BPA)按照体表面积换算后的小鼠相对安全剂量。在此剂量暴露条件下,虽然附睾精子密度与对照组比较无明显差异,但是精子快速运动与前向运动百分比与对照组比较明显下降(P<0.05),精子头部畸形率与对照组比较也有明显升高(P<0.05),曲细精管中空泡化明显,部分生精细胞脱落,睾丸组织中凋亡细胞数目也明显增加,少量精母细胞及精子的线粒体结构出现异常,提示BPA在30 mg/kg/d这个相对“安全剂量”暴露条件下,也具有一定的雄性生殖毒性。对于低于“安全剂量”10倍的3 mg/kg/d BPA组,虽然在睾丸组织超微结构、凋亡细胞数目、精子畸形率等方面与对照组无明显差异,但是精子运动能力与对照组比较有下降趋势,而且在睾丸组织中也观察到了轻微的病理改变,提示BPA在较低剂量暴露条件下可能具有潜在的雄性生殖毒性。(3)BPA诱导的凋亡细胞主要为精母细胞和精子细胞,精母细胞和精子细胞在BPA暴露后线粒体结构出现明显异常,说明精母细胞和精子细胞是BPA通过诱导凋亡发挥雄性生殖毒性作用的主要靶细胞,而线粒体是BPA致生精细胞损伤的重要靶细胞器。2.BPA可通过调控多个生物学功能及信号通路对生精细胞产生毒性作用芯片检测结果显示,BPA染毒所导致的差异倍数大于2以上的基因共有1423个,其中上调基因492个,下调基因931个。差异基因富集分析结果表明:BPA暴露可以导致GC-2细胞胆固醇生物合成、I型干扰素受体结合、细胞凋亡、线粒体细胞色素C释放及ATP复合酶转运等生物学功能异常,主要涉及的信号通路包括Toll样受体信号通路、RIG样受体信号通路、氧化磷酸化信号通路等,提示BPA可能通过调控多个基因及相关信号通路影响GC-2细胞的生物学功能,从而对生精细胞产生毒性作用;另外,我们还筛选出了一些可能在BPA致生精细胞损伤中发挥重要作用并值得深入研究的基因,如XAF1、CHCHD10、Mterf、Irf7等。3.BPA可以通过调控IFNβ-XAF1-XIAP通路诱导生精细胞凋亡(1)BPA暴露可导致GC-2细胞凋亡率明显升高、促凋亡蛋白Bax表达明显上调、抗凋亡蛋白Bcl-2水平明显下降、PARP及caspase 3活化增强,提示BPA可以诱导GC-2细胞凋亡。(2)XAF1在BPA致小鼠雄性生殖毒性体内外染毒模型中的表达均明显上调。特异性敲低XAF1的表达可以部分降低BPA诱导的GC-2细胞凋亡率并能明显抑制BPA诱导的caspase 3蛋白活化,提示XAF1参与BPA诱导的生精细胞凋亡,并在其中具有比较重要的作用。(3)BPA处理后,GC-2细胞中XAF1升高的同时XIAP表达明显降低,特异性干扰XAF1的表达可以部分恢复BPA诱导的XIAP低表达,提示BPA可以通过促进XAF1的表达进而抑制XIAP的抗凋亡作用,从而最终促进GC-2细胞凋亡。(4)芯片结果表明BPA处理后多个干扰素相关基因发生差异表达,提示BPA暴露可以活化干扰素介导的信号通路,进而调控包括XAF1在内的多个干扰素刺激基因的表达。BPA暴露后GC-2细胞及小鼠睾丸组织匀浆液中IFNβ水平明显升高,特异性干扰IFNβ的表达可以明显逆转BPA处理细胞中XAF1蛋白的高表达及XIAP蛋白的低表达,XAF1与IFNβ及XIAP之间存在因果关系。这些结果提示:在BPA染毒GC-2细胞中,IFNβ是XAF1基因一个重要的上游调控因子,BPA可以通过活化IFNβ-XAF1-XIAP通路诱导生精细胞凋亡。4.CHCHD10参与BPA诱导的生精细胞能量代谢障碍及线粒体融合分裂异常(1)BPA暴露可导致GC-2细胞线粒体出现基质型肿胀、线粒体嵴紊乱、空泡变性、线粒体发生片段化、ATP含量下降及ROS水平的增高,且呈一定的剂量-效应关系,提示BPA具有线粒体毒性,可以导致GC-2细胞线粒体形态结构异常及能量代谢等功能障碍。(2)BPA染毒可导致GC-2细胞线粒体呼吸链相关基因的mRNA及蛋白水平明显改变,并导致线粒体分裂蛋白Fis1、p-Drp1表达明显升高而融合蛋白Mfn1、Mfn2及Opa1表达水平显著降低,提示BPA可能通过影响线粒体呼吸链相关基因及线粒体融合分裂关键蛋白的表达导致GC-2细胞线粒体形态结构及功能异常。(3)BPA染毒后GC-2细胞中CHCHD10的mRNA及蛋白表达水平均显著上调,特异性降低CHCHD10的表达能明显逆转BPA暴露引起的GC-2细胞ATP含量下降及线粒体呼吸链相关基因表达的改变,提示CHCHD10可以通过作用于线粒体呼吸链,参与BPA诱导的GC-2细胞线粒体能量代谢障碍。(4)特异性敲低CHCHD10的表达后GC-2细胞线粒体形态发生明显的改变,表现为长管状线粒体增多,说明干扰CHCHD10的表达后线粒体融合增多。另外,干扰CHCHD10的表达能明显改善BPA诱导的线粒体融合分裂失衡所导致的线粒体形态改变,并部分逆转BPA诱导的线粒体分裂关键蛋白p-Drp1的高表达及融合相关蛋白Mfn2、Opa1的低表达,提示CHCHD10参与了BPA诱导的GC-2细胞线粒体融合分裂异常,并在其中发挥重要作用。(5)人群研究表明CHCHD10表达与快速前进精子比例及精子密度和精子总数均呈负相关,提示CHCHD10是精子质量下降的敏感指标。研究结论:1.BPA在较高剂量暴露条件下具有明显的雄性生殖毒性,在较低剂量暴露条件下可能具有潜在的雄性生殖毒性。生精细胞的过度凋亡以及线粒体损伤可能是BPA致生精过程异常,精子质量下降的重要原因。2.BPA可以通过调控Toll样受体信号通路、RIG样受体信号通路、氧化磷酸化等信号通路及相关基因的表达,导致生精细胞多个生物学功能受损,从而发挥其生殖毒性作用。3.BPA可以诱导干扰素相关信号通路的活化并通过调控IFNβ-XAF1-XIAP通路诱导生精细胞过度凋亡。4.我们首次发现CHCHD10基因参与细胞线粒体融合分裂的调控。CHCHD10可通过影响线粒体呼吸链相关基因及线粒体融合分裂关键蛋白的表达,参与BPA诱导的GC-2细胞线粒体损伤。