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慢性粒细胞白血病(Chronic Myelogenous leukemia,CML)是一种以粒系增生为主的造血干细胞恶性增殖性疾病。该病中9号染色体与22号染色体发生了易位,形成费城染色体(Ph)。费城染色体编码融合蛋白BCR-ABL,可以调节细胞体内多条信号通路,特别是激活酪氨酸激酶信号通路可以增加白血病细胞的恶性行为。伊马替尼(Imatinib.ST1571)可以竞争性的结合ABL上的ATP结合位点,是第一个用于CML治疗的酪氨酸激酶抑制剂,对于CML的治疗具有革命性的意义。然而,随着疾病的发展,一些患者中出现了对伊马替尼耐药的现象。研究发现伊马替尼治疗的耐药性主要是因为BCR-ABL融合蛋白的ABL激酶位点区域发生了突变,进而使Imatinib不能与之结合。而非BCR-ABL改变的耐药约占20%。在这些BCR-ABL蛋白激酶区域突变中,T315I突变引起耐药占到了15%~20%。小檗碱(berberine)为黄连、黄柏等多种植物中所含的一种生物碱,具有抗菌消炎,止泻,诱导凋亡和抗癌的效果。近年也发现其具有抗白血病活性。基于本课题前期研究,发现小檗碱具有克服CML的耐药性的作业,但确切的机制还不清楚。本课题首先探究小檗碱对CML细胞的抑制效应,用不同浓度的小檗碱处理对Imatinib敏感的人类CML细胞(K562、BaF3-P210)和耐药性细胞株(BaF3-P210-T315I和SFO2细胞),并与Imatinib对照。实验结果显示,小檗碱在5μM浓度处理24h时,不仅可以抑制敏感K562和BaF3-P210细胞活力,也显著抑制耐药的BaF3-P210-T315I和SFO2细胞细胞活力。伊马替尼和小檗碱联合作用于敏感K562、BaF3-P210和耐药的BaF3-P210-T315I,实验显示,小檗碱可以增加K562、BaF3-P210对伊马替尼敏感性和克服BaF3-P210-T315I细胞对伊马替尼的耐药性性。同时还检测了小檗碱对耐药细胞细胞集落能力(colony)的影响,结果显示,小檗碱可以有效抑制耐药株BaF3-P210-T315I细胞的集落形成,而Imatinib不能显著抑制BaF3-P210-T315I细胞的集落形成;小檗碱也可以有效抑制BaF3-P210细胞的集落形成。进一步研究发现,小檗碱显著降低BaF3-P210-T315I和BaF3-P210细胞系中的BCR-ABL蛋白水平,而对BCR-ABL的mRNA水平无显著改变,因而可以认为小檗碱降解BCR-ABL融合蛋白。最后,为了探索小檗碱降解BCR-ABL蛋白的机制,我们检测了小檗碱处理细胞中的自噬现象和泛素化水平。结果显示,小檗碱处理后细胞中没有发生自噬现象,而在小檗碱处理BaF3-P210细胞,发现小檗碱可以增加细胞的泛素化水平。进而采用针对BCR-ABL免疫沉淀(IP),使用泛素抗体Western blot检测发现BCR-ABL蛋白发生了泛素化。采用Studio 4.1软件对小檗碱与BCR-ABL蛋白进行分子对接模拟,结果显示BCR-ABL共有3部位(SH2区域、蛋白激酶区域和F-肌动蛋白连接区域)可以与小檗碱蛋白分子对接,并在对接处序列发现赖氨酸,提示泛素化位点的存在。因此,小檗碱通过泛素化的机制降解BCR-ABL蛋白进而克服CML的耐药性。小檗碱有可能作为耐药CML的潜在靶向治疗药物。同时,也为中药现代化提供可能的实验依据。