论文部分内容阅读
【目的】研究NFIB在人黑色素瘤发生发展中的作用及分子机制。【方法】利用免疫组织化学染色检测人黑色素瘤组织中NFIB表达情况,通过生物信息学数据库探究黑色素瘤患者生存率与NFIB基因表达的关系;用包装NFIB特异性的si RNA慢病毒(Lv-si NFIB)和包装NFIB c DNA慢病毒(NFIB-c DNA)构建NFIB基因敲低与过表达细胞系,Real time PCR和Western blot(WB)证实其有效性;采用CCK8法、平板克隆形成实验、Transwell小室实验及划痕试验等细胞功能实验检测NFIB基因对黑色素瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;TGF-β诱导恶性黑色素瘤EMT发生,并基于该模型下研究NFIB对恶性黑色素瘤EMT形态学的影响。WB检测上皮间充质转化(EMT)相关蛋白表达。【结果】(1)我们用免疫组化的方法检测了15例黑色素瘤组织、15例良性痣组织及15例人正常皮肤中NFIB表达情况,结果显示NFIB在黑色素瘤组织表达明显高于良性色素痣组织和正常皮肤组织(p<0.001),利用生物信息学中数据库进一步验证后,黑素瘤组织中NFIB相较与良性色素痣和正常皮肤组织中高表达,与标本中免疫组化的结果一致,同时NFIB基因高表达的患者提示与预后不良相关。(2)CCK8实验及平板克隆形成实验表明,si NFIB转染的黑色素瘤细胞增殖能力减弱(p<0.01)、克隆形成率数目降低(p<0.01)。Transwell小室实验及划痕试验显示si NFIB转染的黑色素瘤细胞,其侵袭及迁移数量均降低(p<0.05)。(3)TGF-β1刺激后,NFIB–si Nc组细胞由铺路石样形态改变为梭形细胞,细胞与细胞之间的间隙明显增宽,同一视野内细胞数量减少,符合EMT发生时细胞形态学发生的改变。而NFIB-si RNA组黑色素瘤细胞与TGF-β1组相比,呈铺路石样,细胞之间排列均匀紧密,同一视野内细胞数量明显增多。(4)WB检测显示si NFIB转染的黑色素瘤细胞间质表型标记物如vimentin(p<0.01)、N-cadherin(p<0.05)表达降低,上皮表型标记物ZO-1、E-cadherin表达明显升高(p<0.001)。(5)WB检测显示过表达NFIB的黑色素瘤细胞系ZEB1蛋白表达高于对照组(p<0.01),且间质表型标记物如vimentin、N-cadherin表达升高(p<0.01),上皮表型标记物ZO-1、E-cadherin表达降低(p<0.01)。【结论】本研究发现NFIB在人黑色素瘤组织中高表达,且高表达NFIB的黑色素瘤患者提示预后不良。此外NFIB具有促进黑色素瘤细胞增殖、侵袭、迁移的能力;可通过ZEB1调节黑色素瘤细胞EMT发生,但其具体机制有待深入考证。