论文部分内容阅读
海藻糖是一种天然低聚二糖,是许多植物、昆虫和微生物在逆性环境下的应激代谢物,具有低卡、稳定、保湿和防晒等优点,广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。海藻糖主要是以淀粉为底物经麦芽寡糖基海藻糖合成酶（maltooligosyl trehalose synthase,MTSase,EC5.4.99.15）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（maltooligosyl trehalose trehalohydrolase,MTHase,EC3.2.1.141）连续作用获得,但是目前报道的这两种酶的表达宿主大多为大肠杆菌,其含有的内毒素不利于食品酶的制备,而枯草芽孢杆菌不分泌内毒素,且发酵周期适中、培养方便,是食品级酶制剂表达宿主的最佳选择之一。本实验室前期构建了重组表达Athrobacter ramosus S34来源的MTSase和MTHase的B.subtilis WS11/pHY300PLK-Y和B.subtilis WS11/pHY300PLK-Z,本研究对其进行摇瓶及3-L罐水平的发酵优化,同时分别研究了两种重组酶的酶学性质。构建了重组菌B.subtilis WB600/pHY300PLK-Z和B.subtilis RIK1285/pHY300PLK-Z,并对后者进行摇瓶及3-L罐发酵优化。最后优化了海藻糖的制备工艺,并将此工艺进行中试试验,随后对海藻糖的分离提取条件做初步探索。主要研究结果如下:（1）将重组菌B.subtilis WS11/pHY300PLK-Y进行摇瓶发酵,考察了重组MTSase的pH温度性质。结果表明:该酶的最适温度为45℃、pH 6.0,45℃的半衰期为76 h,与大肠杆菌表达获得的酶相似。进一步优化重组菌的培养基组分,结果表明:其最适碳源和氮源为葡萄糖5 g·L-1、工业蛋白胨10 g·L-1和玉米浆25 g·L-1,此时重组MTSase的酶活为63.2 U·mL-1;在此基础上,探究重组菌在3-L发酵罐中的发酵pH及补料碳氮比。结果表明:在pH 7.0,葡萄糖为补料碳源,工业蛋白胨和玉米浆为补料氮源,C/N为1:1条件下酶活最高为1139.2 U·mL-1,比摇瓶发酵优化前提高了18倍。（2）将重组菌B.subtilis WS11/pHY300PLK-Z进行摇瓶发酵,考察了重组MTHase的pH温度性质。结果表明:该酶的最适温度为55℃、pH 5.5,45℃的半衰期为4 h,与大肠杆菌表达获得的酶相似。进一步优化重组菌的培养基组分及木糖诱导浓度,结果表明:最适碳源和氮源为甘油5 g·L-1、工业蛋白胨25 g·L-1和大豆蛋白胨10 g·L-1,最适诱导浓度为5 g·L-1木糖,此时重组MTHase的酶活为74.7 U·mL-1。在此基础上,探究重组菌3-L发酵罐中的木糖诱导流速及补料碳氮比。结果表明:以甘油为补料碳源、工业蛋白胨和大豆蛋白胨为补料氮源,C/N为2:1,木糖诱导速率为0.5 g·L-1·h-1的条件下发酵,酶活最高为294.2 U·mL-1,仅为摇瓶发酵优化前的3.9倍。该重组菌在3-L罐发酵40 h后酶活迅速降低,存在发酵放大不稳定的问题。（3）为了考察不同B.subtilis宿主菌对MTHase产量的影响,构建重组菌B.subtilis RIK1285/pHY300PLK-Z和B.subtilis WB600/pHY300PLK-Z,其中重组菌B.subtilis RIK1285/pHY300PLK-Z酶活更高为54.7 U·mL-1。接着对该重组菌的培养基组分进行优化,结果表明:最适碳源和氮源为甘油5 g·L-1、大豆蛋白胨25 g·L-1和玉米浆5 g·L-1,此时重组MTHase的酶活为71.3 U·mL-1。并在3-L罐水平上优化该重组菌的补料碳氮比。结果表明:以甘油为补料碳源,大豆蛋白胨和玉米浆为补料氮源,补料C/N为1:1时,酶活最高为816.2 U·mL-1,是重组菌B.subtilis WS11/pHY300PLK-Z最高酶活的2.8倍。（4）在pH 6.0、45℃的条件下,以DE值17-20、浓度为200 g·L-1的大米淀粉为底物,经上述重组酶催化40 h海藻糖转化率为52.6%。由于体系中含有较多的麦芽三糖和麦芽糖等副产物,利用环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）的歧化活性将其聚合度延长,提高底物利用率。与Bacillus stearothermophilus来源的α/β-CGTase复配作用后,催化周期缩短至30 h,转化率提高至68.6%。在此优化基础上进行10吨罐中试试验,转化率为65.4%。随后对海藻糖进行分离提取,分别考察确定了活性炭脱色、离交分离及浓缩结晶的最适条件,海藻糖最终收率为80.1%。