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第一部分调节性T细胞过继转输减轻心肌梗死后心室重塑并改善心功能目的急性心肌梗死后(AMI)持续激活的炎症反应参与心肌梗死后心室重塑的发生发展,然而抑制炎症反应的内源性保护机制尚未明确。CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)是一群具有抑制炎症反应的T细胞亚群。本实验的目的观察Treg对MI后心室重塑和心功能的影响。方法结扎冠状动脉左前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型,假手术的大鼠(Sham)仅予以穿针带线而不结扎。免疫组化的方法检测不同时间点(第3天,第7天和第14天)梗死心脏中Treg的浸润。免疫磁珠分选纯化的Lewis大鼠脾脏调节性T细胞和非调节性CD4+T细胞。将MI大鼠随机过继转输5×106调节性T细胞(MITreg)或非调节性CD4+T细胞(MITconv),部分MI大鼠仅予以相同量的PBS作为阴性对照(MI)。细胞过继后24小时观察过继转输T细胞在梗死大鼠心脏局部和淋巴结的分布。免疫组化的方法观察细胞过继后第3天梗死心脏中Treg的浸润。第28天用超声和血流动力学评估模型大鼠的心室扩张和心功能,指标包括心率(HR),左室收缩末内径(LVESD),左室舒张末内径(LVEDD),分数缩短率(FS),左室收缩压(LVSP),左室舒张末压(LVEDP),左室压力最大上升速率(+dp/dtmax)和最小下降速率(-dp/dtmin), Masson染色法评估梗死区(IZ)的梗死面积及梗死周边区(PIZ)和非梗死区(NIZ)的纤维化,明胶酶谱法评估NIZ的基质金属蛋白酶(MMP)-2的活性,TUNEL法评估PIZ和NIZ的心肌细胞凋亡。结果心肌梗死后的第3天,7天和14天在梗死心脏中均可见Treg,浸润的细胞集中于PIZ且数目在第7天达高峰。过继转输后,Treg能够趋化至MI后梗死心脏和淋巴结并导致PIZ的Treg数目上调。与Sham组大鼠比较,MI组大鼠左心室扩张且心功能减低,LVEDD, LVESD和LVEDP均升高,LVSP, FS,+dp/dtmax和-dp/dtmin均降低。与MI组大鼠比较,MITreg组大鼠的心室扩张和心功能显著改善,LVEDD,LVESD和LVEDP均降低,FS,+dp/dtmax和-dp/dtmin均升高；梗死面积无明显改变,PIZ和NIZ的纤维化,NIZ的MMP-2的活性,PIZ和NIZ的心肌细胞凋亡则显著降低。MiTCONV大鼠与MI组大鼠相比较心功能和心室重塑无明显差异。结论过继转输Treg上调心肌梗死局部的Treg浸润数目,减轻MI后心室重塑并改善心功能。Treg可能作为一种内源性保护机制参与MI后心室重塑的发生发展。第二部分调节性T细胞抑制心肌梗死诱导的炎症反应目的研究Treg对MI诱导的心脏局部炎症反应和系统细胞毒性反应的影响,探讨其减轻心室重塑,改善心功能的作用机制。方法免疫磁珠分选纯化的Lewis大鼠脾脏调节性T细胞和非调节性CD4+T细胞。通过结扎冠状动脉左前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型,假手术的大鼠仅予以穿针带线而不结扎。将MI大鼠随机过继转输5×106调节性T细胞(MITreg)或非调节性CD4+T细胞(MITconv),部分MI大鼠仅予以相同量的PBS作为阴性对照(MI)。免疫组化的方法检测不同时间点(第3天,第7天和第14天)心脏死周边区(PIZ)的炎症细胞包括中性粒细胞(MPO+),巨噬细胞(CD68+)和T淋巴细胞(CD3+)的浸润。RT-PCR的方法比较第7天PIZ炎症细胞因子包括肿瘤坏死因子(TNF)-α,白介素(IL)-1β,转化生长因子(TGF)-β1和IL-10的表达。结晶紫法比较第14天脾脏淋巴细胞对心肌细胞的杀伤能力。流式细胞术评估第14天脾脏CD8+细胞毒性T细胞的增殖。结果心肌梗死后在PIZ区可观察到明显的中性粒细胞,巨噬细胞和T淋巴细胞的浸润。中性粒细胞的数目在第3天达高峰,在第7天和14天恢复至基线水平。巨噬细胞的数目亦在第3天达高峰,在第7天和第14天逐渐降低。T淋巴细胞的数目在第7天达高峰后逐渐降低。与MI组大鼠比较,MITreg组大鼠心肌梗死局部的中性粒细胞,巨噬细胞和T淋巴细胞的数目均降低。与Sham组大鼠比较,MI组大鼠心脏PIZ的促炎因子TNF-α和IL-1β,抗炎因子TGF-β1和IL-10的表达均上调,脾脏淋巴细胞对培养的乳鼠心肌的杀伤能力增加,CD8+细胞毒性T细胞增殖率升高。与MI组大鼠比较,MITreg组大鼠心脏中促炎因子TNF-α和IL-1β的表达减低,抗炎因子IL-10的表达升高,TGF-β1的表达则无明显改变；脾脏淋巴细胞对培养的乳鼠心肌的杀伤能力下降,CD8+细胞毒性T细胞增殖率降低。MITconv大鼠与MI组大鼠相比较心肌局部炎症反应和系统细胞毒性反应无明显差异。结论Treg细胞抑制心肌梗死诱导的心脏局部炎症反应和系统细胞毒性反应,从而减轻心室重塑,改善心功能。第三部分调节性T细胞抑制心肌细胞凋亡的作用机制研究目的研究Treg对心肌细胞凋亡的影响和机制,探讨其减轻心室重塑,改善心功能的作用机制。方法单独培养的乳鼠心室肌细胞,或与免疫磁珠法纯化的Tconv或Treg以10：1比例共培养的乳鼠心室肌细胞,经CD3单抗刺激48小时再予以LPS刺激24小时后,TUNEL法评估心肌细胞的凋亡,ELISA法检测细胞上清中细胞因子TNF-α, IL-1β, TGF-β1和IL-10的浓度。结果心肌细胞单独培养时,与未加LPS的对照组相比(5.2±1.2%),经LPS刺激后的心肌细胞凋亡率明显升高(18.1±1.2%,p<0.01)。与Treg共培养的心肌细胞经LPS刺激后的凋亡率(9.2±1.0%,p<0.01)明显低于单独培养时或与Tconv共培养(18.7±2.5%)。含有Treg的共培养体系细胞上清中的细胞因子TGF-β1和IL-10的浓度明显高于心肌单独培养时或与含有Tconv的共培养体系。在Treg与心肌细胞共培养体系中加入单克隆抗体阻断IL-10的效应或者用半透膜阻断心肌细胞和Treg的直接接触后,心肌细胞凋亡率升高,但仍低于心肌细胞单独培养体系中的凋亡率。加入单克隆抗体阻断TGF-β1后则不影响Treg与心肌细胞共培养体系中心肌细胞凋亡。与心肌细胞单独培养体系比较,加入Treg明显降低心肌细胞TNF-α和IL-1β的分泌。结论Treg通过细胞直接接触和分泌细胞因子IL-10减轻心肌细胞凋亡,并抑制心肌细胞自身炎症因子的分泌。