论文部分内容阅读
白及多糖(BSP)是一种提取于中药白及中的天然植物多糖,BSP具有良好的生物安全性和生物可降解性,因其主链结构是由甘露糖和葡萄糖聚合而成,故主链上存有较多的可反应基团(如羟基),从而使得BSP同时具有良好的结构可修饰性。本论文以BSP为主要基质,通过结构修饰的方法,制备了一种具有pH敏感的两亲性BSP衍生物,当其处于水相溶剂体系中时,可通过两亲性的作用自组装形成纳米颗粒(NPs),并对弱酸性条件产生pH敏感性。因肿瘤组织中的pH环境呈弱酸性,进一步的,可以通过NPs结构中的疏水内核包载抗肿瘤功效的疏水性药物(如阿霉素等药物),从而形成靶向至肿瘤组织的智能纳米给药体系。本论文从材料结构的角度上探究了NPs的性质;在细胞水平上评价了NPs的细胞毒性、肿瘤细胞抑制率、细胞摄取以及药物在细胞内的分布等;在个体水平上以荷瘤小鼠为模型,探究了载药NPs的抑瘤活性、体内分布以及主要脏器与肿瘤部位的病理学分析。首先,从中药白及中提取得BSP,经过除色素、脱蛋白、阴离子交换纤维素柱层析以及葡聚糖凝胶柱层析等方法对BSP进行了纯化。通过结构解析得知,BSP主要由β-甘露糖与β-葡萄糖组成,两者相对摩尔比例为4.8:1,经HPGPC检测显示BSP呈对称均一的峰形,分子量为178kDa,经傅立叶变换-红外光谱(FT-IR)检测显示其具备多糖特征峰;进一步地,采用核磁共振(NMR)确认了BSP的结构;BSP是一个分子量集中、结构均一、纯度较高的多糖化合物;在此基础上,对BSP进行了三个步骤的结构修饰,因组氨酸在酸性环境下咪唑环会发生质子化从而产生pH敏感性,故组氨酸(His)将作为pH敏感基团。第一步是合成羧甲基化白及多糖(C-BSP),第二步是把His基团修饰到C-BSP结构上,第三步是在His-BSP结构上引入疏水基团硬脂酸(SA),得产物His-SA-BSP。通过FT-IR和NMR和对每个步骤的产物结构分别进行了表征,均证实已成功修饰。随后通过超声波分散的方法将His-SA-BSP在水相体系中制备纳米颗粒(NPs),对其相关性质进行了测试,发现当所处环境pH值降低,NPs结构发生了膨胀;随着pH的减小,NPs的Zeta电位增大,并出现了电荷反转的现象;随着His基团取代度的增加,His-SA-BSP NPs的临界胶束浓度(CMC)呈现下降的趋势;最后检测了NPs的酸性解离值(pH_d),得知NPs在pH=5.0左右的条件下其结构发生解离。以阿霉素(Dox)为模型药物,将其搭载于NPs中。通过X射线衍射仪(XRD)与FT-IR对其检测,载药NPs中均未检测到Dox的特征峰,表明已将成功搭载Dox。随后对载药NPs的相关性质进行测试,当所处pH由7.4降至5.0时,NPs粒径由120nm急剧增加至530nm,通过透射电镜(TEM)也观察到同样的膨胀现象;另外,随着pH环境从7.4下降至4.0,NPs的Zeta电位从-13mV增加至19mV,并且在pH为6.5的时候发生了由负到正的电荷反转。进一步的制备了Dox-SA-BSP NPs作为对照进行了体外释药实验,pH=5.0时,Dox-His-SA-BSP NPs中70%的Dox在36小时内释放,同样的条件下,Dox-SA-BSP NPs释放了40%的Dox,验证了His-SA-BSP的pH敏感性是源自于聚合物中的His基团。在细胞水平上,采用CCK-8法证实了以BSP为主要基质构建的NPs具备极低的细胞毒性。搭载药物后,显示Dox-His-SA-BSP NPs具有最好的抑瘤活性。细胞摄取方面,在每一个采集时间点,Dox-His-SA-BSP NPs组均具有更强的荧光强度。通过激光共聚焦显微镜观察Dox-NPs在肿瘤细胞中的分布定位,结果显示His-SA-BSP NPs被细胞内化后,首先出现于溶酶体中,在溶酶体的酸性条件下(pH=4~5)使NPs发生溶胀,加速了NPs的解离,导致Dox释放到细胞核。进一步研究表明,His-SA-BSP NPs是通过多途径机制进入肿瘤细胞内部,其中细胞胞饮途径是NPs内化的主要途径。以鼠源乳腺癌的BALB/C裸鼠为动物模型,对His-SA-BSP NPs在小动物活体内部的情况也进行了分析一方面采用包载DIR探针的方式,通过小动物活体光学成像系统探究NPs的靶向性与体内分布情况,相较之下,His-SA-BSP把药物递送至肿瘤部位更有效,较大幅度提高药物向肿瘤部位的递送效率,同时增加药物在肿瘤部位的积蓄。另一方面通过注射Dox、Dox-SA-BSP NPs和Dox-His-SA-BSP对小鼠进行了抗肿瘤治疗,治疗期间,Dox组与生理盐水组的小鼠体重出现了降低,而两个BSP NPs组未出现该情况,说明BSP NPs具有良好的生物相容性;治疗结束后,Dox-His-SA-BSP组在四个实验组中有最好的治疗效果。通过病理学研究发现,BSP NPs组并未观察到主要脏器组织病变等情况,并且His-SA-BSP组的肿瘤中发现了严重的细胞凋亡等情况,表明了His-SA-BSP组具有优异的肿瘤靶向,同时具备较好的生物相容性。