论文部分内容阅读
土壤盐渍化是制约人类生存发展的重要问题。在全球人口持续增加、粮食需求逐年上升,而耕地急剧减少、作物单产和总产徘徊不前的现状下,最大程度地利用盐渍化土地发展盐碱地农业将有助于保障粮食安全,以实现盐碱地最大经济效益。同时,当今世界还面临着能源短缺问题,如何利用现有盐碱地资源开发和生产生物质能源,实现“不与粮争地”,对保障我国能源安全同等重要。因而,提高作物耐盐性,进而利用盐碱地提高粮食产量并开发生物能源,具有重大战略意义。甜高粱[Sorghum bicolor（L.）Mocnch],具有“粮食-经济-饲草”三元种植作物的特点,作为我国主要生物质能源作物用于生产燃料乙醇,同时也是生产糖、糖浆、味精和酒的原料,具有良好的研究潜能和实用价值。由于甜高粱具有耐盐碱、抗旱、耐涝等优良特性,对土壤的适应力强,能够在盐碱、干旱、涝等不良环境中生长,加大对甜高粱耐盐机制的研究,培育耐盐新品种,有助于充分利用我国盐碱地发展生物燃料和现代畜牧业。本论文以耐盐甜高粱自交系M-81E和盐敏感自交系Roma为材料,首先确定质外体屏障在拒盐中的作用,然后筛选参与拒盐的关键基因,重点从生理、细胞、分子等方面研究甜高粱Sb CASP4和Sb CASP-LP1C1在质外体屏障形成及拒盐中的作用机理,为下一步利用转基因技术培育耐盐高产甜高粱新品种奠定基础。本论文主要结果如下:（1）甜高粱拒盐性与质外体屏障密切相关在50 m M Na Cl处理下,甜高粱耐盐自交系M-81E和盐敏感自交系Roma表现为相似的根及叶片钠离子含量和较强的拒盐能力,但在100 m M Na Cl的处理下,Roma的生长被显著抑制,其叶片Na+含量急剧增加且与根中Na+含量差距减小,这与Na+大量进入地上部分密切相关,而M-81E拒盐能力较强,能有效抑制Na+向地上部分的运输,表现为其叶片Na+含量增加量较少。对盐处理下M-81E与Roma根切片染色结果表明,根部内皮层质外体屏障（木质化和栓质化）均受到盐诱导而加厚,且拒盐能力强的M-81E比拒盐能力弱的Roma诱导加厚的程度大。这些结果说明根内皮层质外体屏障参与了甜高粱的拒盐作用。（2）甜高粱根质外体屏障发育模式及位置的确定为进一步确定拒盐能力是否与根不同组织细胞数目有关及与质外体屏障的关系,观察统计了甜高粱根横切片的表皮细胞数、皮层细胞层数、内皮层细胞数、原生木质部导管数、双生木质部导管数、后生木质部导管数。结果表明,盐处理等条件下两个自交系距根尖不同位置并未出现明显差异,说明拒盐能力与根不同组织细胞数目无关。在0、50 m M Na Cl处理4天后,对M-81E与Roma的凯氏带和栓质发育情况进行组化染色,了解其发育过程,发现对照组中,M-81E与Roma凯氏带和栓质的发育位置基本一致;盐处理组中,M-81E的凯氏带和栓质发育没有向根尖推进,而Roma的凯氏带和栓质发育较对照组迟缓,距根尖较远。根据凯氏带和栓质的形成情况,我们将M-81E与Roma质外体屏障的发育分为3个时期:Stage I（无凯氏带和栓质形成）、Stage II（凯氏带和栓质正在形成）和Stage III（凯氏带和栓质完全成熟）。Stage I均在距根尖0-10 mm;Stage II和Stage III因自交系不同和是否盐处理分布迥异。Stage II:M-81E对照组和盐处理组均在距根尖20-25 mm处,而Roma对照组在距根尖20-30 mm处,盐处理组在25-35 mm;Stage III:M-81E对照组和盐处理组及Roma对照组在距根尖35-45 mm处,而Roma盐处理组在45-55 mm。这些结果表明,甜高粱拒盐能力与根质外体屏障有关。以上结果为下一步准确截取和收集不同根段用于转录组测序,筛选质外体屏障相关基因奠定了基础。（3）甜高粱质外体屏障形成的相关基因筛选收集0、50 m M Na Cl处理前后的M-81E及Roma根三个不同发育时期根段材料并提取RNA进行高通量转录组测序,筛选出与质外体屏障发育相关的基因。由于M-81E已经被证实为拒盐性较强的自交系,因此,优先分析在M-81E对照组三个不同根段中,质外体屏障前体合成、运输、聚合、表达调控等多个方面的差异表达情况,筛选可能参与质外体屏障发育的相关基因。根据不同通路和途径中基因表达情况,挑选了12个差异表达的候选基因。对0、50m M Na Cl处理4天的两个自交系根的Stage II候选基因进行定量分析,发现两个自交系中Sb CASP4和Sb CASP-LP1C1在盐处理后都出现较高表达,推测这两个基因参与了质外体屏障的合成过程,进而影响了甜高粱的拒盐能力。同时,结合原位杂交结果,表明这两个基因在甜高粱根内皮层处进行表达,进而证明其参与质外体屏障的发育过程。（4）Sb CASP4和Sb CASP-LP1C1及其启动子克隆及功能研究进行Sb CASP4和Sb CASP-LP1C1全长克隆,利用Ex PASy、TMHMM、SMART在线软件对两个基因及其启动子进行生物信息学分析,为进一步研究其功能奠定基础。构建35S:Sb CASP4-GFP和35S:Sb CASP-LP1C1-GFP表达载体,对两个基因进行烟草亚细胞定位分析,发现其均定位于细胞质膜。通过异源过表拟南芥,获得阳性纯合株系研究Sb CASP4和Sb CASP-LP1C1基因功能。用三引物法筛选拟南芥突变体CS1015546和SALK-002445,作为验证基因功能的材料。使用基因特异性启动子构建p Sb CASP4:Sb CASP4-GFP、p Sb CASP-LP1C1:Sb CASP-LP1C1-GFP、p Sb CASP4:GUS和p Sb CASP-LP1C1:GUS表达载体,转化拟南芥,筛选阳性株系,作为观察基因表达模式的材料。对拟南芥野生型、过表达株系、突变体进行耐盐性验证,发现在对照条件下,三者无显著差异。测定50 m M Na Cl条件下生长、根和叶片离子含量、PI染色、质外体组化分析等相关生理指标,发现过表达株系在50 m M Na Cl条件下的拒盐能力显著高于野生型和突变体,突变体拒盐能力最差。通过测定相关基因表达量发现,盐处理提高了凯氏带聚合基因的表达,说明盐诱导下,基因Sb CASP4和Sb CASP-LP1C1通过加强凯氏带聚合,增加了质外体屏障的厚度,进而提高了过表达拟南芥的抗盐性。Sb CASP4启动子连接GFP表达载体,通过观察转基因株系萌发期根中GFP的表达,发现其定位在内皮层凯氏带区域,说明该基因确实在凯氏带区域行使功能。启动子连接GUS表达载体获得转基因株系后,对培养4天的幼苗进行GUS染色分析,结果显示两个基因均在根中柱启动表达。对培养10天至长出两片真叶的幼苗GUS染色分析,发现Sb CASP-LP1C1启动子在下胚轴处特异启动。推测与启动子元件中分生组织表达元件有关,由于该基因是定位于膜上的锚定蛋白,因此推测该基因表达后可能锚定在下胚轴细胞壁上,进而影响幼苗发育。值得注意的是,过表达株系幼苗在下胚轴位置出现了分枝,辅以GUS染色,对分枝相关基因（SMXL6/7/8）进行表达量测定,发现基因表达量在过表达株系中高于野生型拟南芥,推测基因Sb CASP4、Sb CASP-LP1C1可能通过大量锚定在下胚轴细胞质膜上,表现为对分枝的影响,其详细机制有待进一步研究。