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【背景及目的】转铁蛋白受体（Transferrin Receptor,TfR）属于细胞膜Ⅱ型跨膜糖蛋白,与细胞铁摄取有关,影响细胞的生长和增殖。TfR在正常组织细胞中表达较低,而在肿瘤细胞表面表达增加,由于肿瘤细胞增长快速,需要合成更多DNA,核苷酸还原酶需要更多的辅因子铁,从而迫使肿瘤细胞上调TfR的表达。文献报道以及课题组前期研究证明,肿瘤细胞表面的TfR与转铁蛋白的亲和力是正常细胞的10100倍。同时,TfR的表达水平与肿瘤的分期和预后息息相关。TfR以其胞外段结合特性、内吞性和在人类肿瘤细胞病理学上的作用特点,作为肿瘤靶向显像和治疗的一个重要特异性标志备受关注。然而在肿瘤的靶向生物治疗中,如何获得高效、特异、稳定的抗体是有待解决的关键问题。本课题旨在前期构建抗TfR scFv和双价表达载体的基础上,进一步设计与构建新型抗TfR四价基因工程抗体（TfR-TeAb）,建立稳定表达细胞株,探索优化其真核表达与培养条件,以及探讨四价抗体的生物学效应,为其联合抗体依赖的效应细胞,如NK细胞治疗肿瘤研究奠定基础。【实验方法】1.基因扩增与表达载体的构建以本课题组前期构建的抗TfR双价抗体载体TfR-scFv-Fc为模板,设计引物通过overlap PCR获取VL-Linker-VH基因片段。将VL-Linker-VH基因片段插入TfR二价抗体载体的VH-Linker-VL基因片段与Fc基因片段之间,构建抗TfR四价抗体真核表达质粒TfR-（scFv）2-Fc,即TfR-TeAb的表达载体。2.四价抗体TfR-TeAb表达载体稳转细胞株以核转染的方法将TfR-TeAb质粒转染DHFR基因缺陷的CHO-DHFR-细胞,即DG44细胞;应用选择性培养基进行选择性培养,待细胞扩增后采用有限稀释法挑选单克隆,添加甲氨蝶呤（Methotrexate,MTX）进行加压,获得多株单克隆细胞株;通过ELISA检测各单克隆细胞株上清中抗体浓度,筛选相对高表达的稳转细胞株;应用FCM检测稳转细胞株所产抗体与TfR的结合能力,筛选出能够分泌与TfR特异性结合的TfR-TeAb的细胞克隆。3.四价抗体TfR-TeAb的纯化及鉴定将稳转细胞株扩大培养,收获无血清表达上清,离心后过滤,应用Protein A纯化抗TfR四价抗体TfR-TeAb。（1）应用SDS-PAGE分析四价抗体TfR-TeAb的纯度、分子量;（2）应用FCM检测293T细胞瞬转上清与hTfR稳定表达的细胞系CHO-hTfR及空载对照细胞系CHOvec结合的活性及特异性;（3）通过ELISA方法测定四价抗体TfR-TeAb与TfR的亲和力常数。4.四价抗体TfR-TeAb的生物学效应研究（1）采用FCM检测HepG2及MDA-MB-231细胞表面TfR的表达量;（2）应用CCK（Cell Counting Kit）检测TfR-TeAb对HepG2增殖的影响;（3）通过共聚焦显微术观察TfR-TeAb与HepG2细胞结合后介导的内吞效应;（4）应用FCM检测TfR-TeAb联合PBMC对肿瘤细胞的杀伤效应。5.GRP78对工程细胞CHO生长曲线及其抗体产生影响的分析（1）CHO-GRP78稳转细胞系:将TfR-TeAb表达载体转染CHO-GRP78及CHO细胞1)应用ELISA检测不同时间点培养上清中TfR-TeAb的浓度;2)通过FCM检测各时间点培养上清中TfR-TeAb与HepG2细胞的结合,并用PI染色检测CHO-GRP78细胞及CHO细胞的存活率;3)采用台盼蓝染色计数每个时间点CHO-GRP78及CHO的活细胞数量。（2）无血清培养条件下,CHO-GRP78细胞的凋亡及死亡率低于CHO细胞（24h,P<0.05;48h,P<0.01）。采用Western blot进一步检测caspase-3活化情况。【实验结果】1.基因的获取及表达载体的构建以抗TfR抗体“信号肽-VH”载体和“VL”载体为模板,通过重叠延伸PCR扩增获得VH-linker-VL-GCTAGCACCGGATCC序列（NheI-Linker2-BamHI）。然后将目的基因用NotI/BamHI双酶切克隆至经相应双酶切的Fc-pOptivec质粒中,获得TfR-VH-Linker-VL-Fc表达载体,命名为TfR-scFv-Fc载体。TfR-scFv-Fc经哺乳动物细胞表达后可通过Fc段铰链区二硫键作用形成双价抗体;以上述TfR-scFv-Fc载体为模板,通过PCR扩增,分别获得NheI-Linker2-VL-linker（1/2）和linker（1/20）-VH-BamHI基因。进一步采用重叠延伸PCR扩增获得NheI-Linker2-VL-linker-VH-BamHI基因,经酶切电泳鉴定与测序验证后,将NheI-Linker2-VL-linker-VH-BamHI经NheI/BamHI酶切克隆至经相应双酶切的TfR-scFv-Fc质粒中,获得目标序列VH-Linker-VL-Linker2-VL-linker-VH-Fc,即TfR-（scFv）2-Fc。TfR-（scFv）2-Fc可Fc形成四价抗体。序列分析结果表明TfR-TeAb真核表达载体构建成功,命名为TfR-（scFv）2-Fc。2.TfR-TeAb的瞬时表达及活性鉴定将TfR-（scFv）2-Fc（TfR-TeAb真核表达载体）瞬时转染293T细胞。FCM检测结果显示,瞬时表达上清可与稳定表达hTfR的细胞系CHO-hTfR结合,其阳性率高达98.4%,而与对照细胞系CHOvec结合阳性率仅为0.2%。结果表明TfR-（scFv）2-Fc可成功表达TfR-TeAb,且TfR-TeAb可与细胞膜表面TfR特异性结合。3.TfR-TeAb稳转细胞株的建立将TfR-TeAb质粒稳定转染DG44细胞,采用有限稀释法挑选单克隆,获得多株单克隆细胞株。采用ELISA检测各单克隆细胞株上清中抗体浓度筛选出相对高表达的六株稳转细胞株;进一步应用FCM检测六株稳转细胞株所产抗体与细胞膜TfR的结合能力,结果表明六株细胞克隆分泌的TfR-TeAb均可与稳定表达hTfR的细胞系CHO-hTfR特异性结合。再根据细胞状态选择出三株稳转细胞株。结果提示成功建立抗TfR四价抗体TfR-TeAb稳转细胞株,命名为DG44-TfR-TeAb,并获得三株相对高表达特异性与TfR结合的TfR-TeAb的单克隆细胞株,克隆号分别为C2、C9、C14。4.TfR-TeAb的生物学特性（1）应用Protein A纯化TfR-TeAb。SDS-PAGE结果显示在80kD处可见清晰条带,且基本无其他条带。结果表明获得高纯度TfR-TeAb,变性后其分子量约为80kD与理论值相符;进一步用非变性缓冲液处理TfR-TeAb,SDS-PAGE结果显示在160kD处可见清晰条带。结果说明TfR-（scFv）2-Fc在DG44细胞中表达后成功形成二聚体。（2）通过ELISA测定四价抗体TfR-TeAb的亲和力常数为4.263×109M-1,亲本鼠源单抗Mouse mAb的亲和力常数为2.908×109M-1。结果表明TfR-TeAb的亲和力常数比亲本抗体的高,即四价抗体亲和力较亲本抗体有所提高。5.TfR-TeAb的生物学效应（1）HepG2及MDA-MB-231细胞表面TfR的表达:采用FCM检测HepG2及MDA-MB-231细胞表面TfR的表达,结果显示TfR在HepG2及MDA-MB-231细胞表面均高表达,两株细胞表达无明显差异;（2）TfR-TeAb对HepG2增殖的影响:CCK检测结果表明抗体单独作用于HepG2对其增殖影响不明显;（3）TfR-TeAb介导TfR内吞作用:共聚焦显微术观察可见TfR四价抗体TfR-TeAb与HepG2细胞膜表面TfR结合后内吞入细胞浆;（4）TfR-TeAb介导的ADCC效应:FCM检测TfR-TeAb介导的对肿瘤细胞的ADCC效应,结果表明TfR-TeAb能够介导ADCC效应杀伤HepG2细胞及MDA-MB-231细胞,提示TfR-TeAb可介导ADCC,但对两种细胞杀伤率有明显差异（P<0.001）。6.GRP78对抗体产量及抗体宿主细胞的抗凋亡作用的影响（1）CHO-GRP78稳转细胞株及CHO细胞分别瞬时转染TfR-TeAb1)GRP78能够提高四价抗体TfR-TeAb的产量:ELISA检测结果显示第5天、第7天、第9天时CHO-GRP78细胞培养上清中TfR-TeAb浓度高于CHO细胞培养上清中的浓度（5d,P<0.05;7d,P<0.05;9d,P<0.01）。2)GRP78可增强宿主细胞的存活率,提高其活细胞数量:在各时间点,CHO-GRP78细胞存活率均显著高于CHO细胞存活率（3d,P<0.05;5d,P<0.05;7d,P<0.001;9d,P<0.001;11d,P<0.01）。第9天时,CHO细胞活细胞数已低于1×106,而第11天时,CHO-GRP78细胞活细胞数仍高于2×106;说明GRP78能够增强宿主细胞的存活率,提高其活细胞数量。（2）GRP78可通过抑制caspas-3的活化使宿主细胞抵抗无血清培养诱导的凋亡。宿主细胞无血清培养后,采用Western blot检测CHO-GRP78细胞及CHO细胞中Cleaved-caspase-3的表达水平。结果显示:CHO-GRP78细胞中Cleaved-caspase-3的表达量均明显少于CHO细胞中的表达量（24h,P<0.05;48h,P<0.001）。【结论】本课题研究结果表明:（1）成功构建新型抗TfR四价抗体TfR-TeAb,利用DHFR系统并筛选获得了稳转四价抗体载体的CHO-DHFR-细胞株DG44-TfR-TeAb;（2）大量表达经Protein A纯化获得四价抗体TfR-TeAb,其分子量正确、纯度高、结合活性好、特异性高、亲和力较亲本抗体高;（3）TfR-TeAb与细胞膜表面TfR结合后可介导内吞,提示TfR-TeAb亦可用于带药入胞;（4）TfR-TeAb联合PBMC发挥ADCC效应从而杀伤肿瘤细胞;（5）研究发现GRP78能够增强抗体宿主细胞无血清培养条件下抗凋亡能力,从而提高细胞存活率及活细胞数量,进而增加TfR-TeAb的产量。同时,我们惊喜地发现,四价抗体瞬时转染CHO-GRP78与CHO细胞,第3天、第11天时两组上清中TfR-TeAb的浓度无明显差异,而上清与HepG2细胞结合的平均荧光强度有明显差异,说明GRP78能增强TfR-TeAb结合能力。由此可见,GRP78在生物制药行业具有潜在的应用价值。