研究背景与总体思路大量的基础和临床研究证实,缺血心肌再灌注后,缺血心肌细胞损伤会加重,包括心肌功能进一步受损、代谢异常以及心肌超微结构的改变进一步加重,即心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤。再灌注损伤机制复杂,可通过多种途径产生,氧自由基的作用是I/R的重要发病环节,是细胞衰老和死亡的重要因素。心肌细胞凋亡与I/R密切相关,线粒体膜通透性转变孔(mitochondrial permeability transition pole,mPTP)具有调节心肌细胞凋亡的作用,在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用,多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡,而线粒体跨膜电位Δψm的下降,被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件,它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前,一旦线粒体DYmt崩溃,导致电子传递链中断,氧化磷酸化停止,细胞内氧自由基水平上升,ATP水平下降,改变细胞电化学氧化还原状态以及释放Caspase激活物,直接导致细胞凋亡或死亡。稳定线粒体膜电位Δψm,阻止线粒体膜通透性改变,可以逆转濒临凋亡的心肌细胞。因此研究心肌细胞凋亡的保护因子是当前的热点之一。CT-1是新近从小鼠心脏发育的胚胎干细胞中克隆出的一种细胞因子,主要表达于心肌细胞和心肌成纤维细胞,它参与调节心脏正常生理过程,具有促进心脏正常发育和促使细胞存活的作用。作为IL-6超家族成员,CT-1与受体gp130和或LIFRβ结合后,具有IL-6样作用,合成急性期反应蛋白,产生心肌保护作用。研究证实,急性心梗后缺血心肌CT-1表达明显增多,从而减少心肌细胞的死亡丢失,促进残余细胞的存活,并使成纤维细胞迁徙促进梗死区愈合,保护心功能。体外研究发现CT-1能增强新生大鼠心肌细胞在无血清培养基中的存活,CT-1诱导热休克蛋白hsp70和hsp90的过度表达,后者对培养新生心肌细胞的热休克或缺血缺氧的刺激有保护作用。以上均表明CT-1与心肌的损伤和功能有着密切的关系。为此我们设想,CT-1亦可能在大鼠急性I/R损伤心肌细胞代谢和功能的损害中发挥作用,并可能作为细胞内一种内源性保护物质,对减轻I/R损伤起着重要的保护作用。我们前期研究发现,CT-1通过JAK/STAT3信号通路介导高静水压促心肌成纤维细胞增殖,ERK1/2通路抑制其促增殖作用,PI3K信号通路则不参与CT-1的促心肌成纤维细胞增殖作用。那么,CT-1在心肌缺血和再灌注损伤中的作用机制如何,以及通过哪些信号转导途径发挥作用,如何发挥作用,尚需进一步的研究来证实。因此本研究:首先利用离体Langendorff缺血再灌注心脏,通过观察CT-1对离体缺血再灌注心脏心肌梗死范围,再灌注心律失常,心功能的影响,以及心肌的病理改变等,心肌eNOSmRNA和iNOSmRNA表达的变化,并利用信号通路阻断剂阻断CT-1的作用;从离体器官水平,研究CT-1是否对缺血再灌注心脏的心肌损伤具有直接的保护作用,并初步探讨CT-1的作用机制。其次利用离体培养的心肌细胞急性缺氧-复氧模型模拟心肌缺血再灌注损伤,通过观察CT-1对缺氧-复氧后心肌细胞成活率、心肌细胞凋亡的影响,及心肌细胞受损时心肌细胞线粒体膜电位(Δψm)、心肌细胞ROS等的变化,证实CT-1在心肌细胞缺血再灌注损伤中所起的作用及机制。并应用信号通路阻断剂及细胞因子信号抑制子-1(SOCS1)反义寡核苷酸技术,进一步阐明CT-1对心肌细胞缺血再灌注损伤保护作用的机制及信号转导途径;通过检测分化与凋亡相关基因的表达,从细胞和分子水平,论述CT-1如何通过其信号通路来保护心肌细胞免受缺血再灌注的损伤。第一部分:CT-1对大鼠缺血再灌注损伤心肌的保护作用及机制探讨目的利用Langendorff灌流装置,建立离体大鼠I/R心脏模型,通过检测心肌梗死范围、心律失常、心肌酶学、心功能及病理改变,评估CT-1对缺血再灌注损伤大鼠心脏的作用;同时检测心肌eNOSmRNA表达和iNOSmRNA表达,初步探讨CT-1的作用机制。从离体整体心脏水平,探讨CT-1是否对缺血再灌注损伤的心肌有保护作用,以及保护的机制如何。方法大鼠分为6组(n=12)(1)对照组;(2)缺血-再灌注组(IR组);(3)CT-1组1(缺血前加CT-110μg/l);(4)CT-1组2(缺血后加CT-110μg/l);(5)CT-1+LY294002组;(6)CT-1+PD98059组。LY294002,PD98059分别是PI3K /Akt、ERK1/2通路阻断剂, 0.1M的氢氧化钠溶解,并用磷酸缓冲液(PBS)调节pH值至7.4,灌流浓度分别是5μM和10μM。摘取大鼠心脏后进行离体Langendorff灌流,平衡15min,结扎30min ,再灌60min。恒压灌注,多导生理记录仪分别记录心率,心律,左室收缩压(LVSP)和左室内压力的变化速率(±dp/dtmax),计算冠脉流量,结合灌注压计算冠脉阻力,描记压力-容量曲线(P-V)计算左室舒张期顺应性。留取灌流液检测LDH、CK水平。灌注结束后采用氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液染色法测定心肌梗死范围,显微镜观察心肌病理变化,并取心室肌检测iNOSmRNA和eNOSmRNA表达。结果1、心律失常:IR组在缺血期间就出现早搏、短阵心动过速等心律失常;再灌注期间心率变慢,频繁的早搏、心动过速,甚至发生室颤等恶性心律失常。再灌注前经CT-1灌注预处理,无论缺血前或缺血后,心律不齐均出现晚,仅出现偶发的早搏,再灌注后早搏的次数明显减少,心动过速发生的次数少和持续时间短(P<0.05)。分别加用信号通路阻断剂LY294002(Akt/PI3K阻断剂),PD98059(ERK1/2阻断剂)灌注,能够抑制CT-1的改善心律失常作用,心律失常再次增加,出现明显的早搏、心动过速(P<0.05),甚至发生室颤。2、心肌损伤:IR组的心肌梗死范围为38.6±4.62%,CT-1组1和CT-1组2心肌梗死范围分别是22.5±3.15%和23.7±2.75%,均明显小于IR组(P<0.05)。各组I/R前LDH、CPK基线值差异无统计学意义,缺血30min后,LDH、CPK除CT-1组1变化不明显外,其它组均较缺血前升高。再灌注60min后,IR组LDH、CPK进一步升高,与再灌注前比较有显著的差异性。两CT-1组再灌注60min后LDH、CPK均较IR组下降,但与缺血30min后比较,仍有升高。表明,无论CT-1在缺血前或缺血后处理,均可以明显改善缺血-再灌注引起的心肌损伤。而CT-1处理后分别给予LY294002和PD98059处理,均能部分消除CT-1处理的这种保护作用。3、心功能:与缺血前比较,IR组心脏缺血30min后,LVSP和+dp/dtmax、-dp/dtmax明显下降,左室舒张期僵硬度增加,顺应性下降;再灌注30min后,上述参数进一步恶化,随后虽有所恢复,但再灌注60min后,LVSP和+dp/dtmax、-dp/dtmax仍低于缺血前,左室舒张期僵硬度高于缺血前。CT-1无论缺血前或缺血后处理,再灌注60min后,LVSP和+dp/dtmax、-dp/dtmax均较IR组明显提高,左室舒张期僵硬度较IR组低,但CT-1的这种效应可被两种通路阻断剂阻断。4、冠脉流量:各组离体IR前冠状动脉流量、冠脉阻力基线值差异无统计学意义。缺血30min后,冠状动脉流量除CT-1组1变化不明显外,其它组均较缺血前明显下降,而冠脉阻力则显著增加。再灌注60min后,IR组冠脉流量虽有所恢复,但较缺血前明显下降(8.1±0.7VS 10.8±0.9ml/min)。两CT-1组再灌注60min后冠脉流量稍有下降,但与缺血前比较,无统计学差异。而与I/R组比较,再灌注明显多于I/R组,冠脉阻力明显下降,表明,无论CT-1在缺血前或缺血后处理,均可以明显改善缺血再灌注心脏的血液供应。5、心肌iNOSmRNA和eNOSmRNA表达:心脏缺血-再灌注后,心肌iNOSmRNA表达较对照组明显上调,而eNOSmRNA表达则明显下调(0.579±0.046VS 1.973±0.147,P<0.05)。而无论缺血前还是缺血后使用CT-1处理,心肌iNOSmRNA表达均较IR组明显下调,eNOSmRNA表达上调(1.892±0.162VS 0.579±0.046,p<0.05);分别给予通路阻断剂LY294002和PD98059处理,iNOSmRNA表达较两CT-1组明显升高,eNOSmRNA表达下降;助溶剂DMSO组与CT-1组无差异。表明CT-1能够减少缺血再灌注心肌iNOSmRNA表达,升高eNOSmRNA表达。而LY294002和PD98059组的iNOSmRNA表达均明显高于两CT-1组,而eNOSmRNA表达则明显低于CT-1组。讨论与结论缺血导致心肌损害,而再灌注就象双刃剑,通过改善心肌氧供和限制心肌细胞“自溶”来减少梗死面积;同时引起心脏局部细胞因子网络的失衡及某些细胞因子、粘附分子的过度表达,增加心肌损伤,在一定程度上降低了再灌注的疗效。但与此同时机体为应对缺血/再灌注损伤的打击,会产生一些具有保护性非特异性蛋白,分泌一些内源性保护性物质,对抗应激造成的损害。主要来源于心室肌细胞的CT-1,除具有促进心脏正常发育和促使细胞存活的作用外,作为IL-6家族成员,合成急性期反应蛋白,产生心肌保护作用。本研究利用离体Langendorff灌流心脏,发现再灌注开始,左室收缩压、左室心肌收缩性不但不改善,反而比缺血时有所减弱,冠脉流量减少,而冠脉阻力则增加。CT-1预处理后明显减轻缺血再灌注后心肌损伤,减少再灌注心律失常的发生,特别是室性心动过速等恶性心律失常的发生,明显缩小心肌梗死面积,降低冠脉阻力,增加冠脉灌流量,改善心肌收缩性和左室舒张期僵硬度。而使用ERK1/2和PI3K信号通路阻断剂,可取消CT-1预处理对心脏的保护作用。表明CT-1对缺血再灌注损伤心肌有保护作用,提示CT-1可以作为一种治疗性蛋白对抗心肌缺血再灌注引起的损伤。并通过上调eNOSmRNA表达,减少iNOSmRNA,调控NO的合成抑制心肌损伤。第二部分CT-1对心肌细胞急性缺氧复氧损伤的保护作用机制及信号转导目的本部分以体外培养的心肌细胞为研究对象,利用心肌细胞急性缺氧复氧模拟心肌缺血再灌注损伤,通过观察CT-1对急性缺氧复氧时心肌细胞成活率、心肌细胞凋亡,心肌肌酸激酶等的影响,及心肌细胞受损时心肌细胞线粒体膜电位(Δψm)、心肌细胞ROS、NADPH氧化酶复合物亚单位nox-1蛋白表达等的变化,进一步探讨CT-1在心肌细胞缺血再灌注损伤中所起的作用及机制。通过使用CT-1信号通路阻断剂LY294002,PD98059及信号抑制子(SOCS1)反义寡核苷酸(ASODN)转染心肌细胞,从细胞和分子水平阐明CT-1对心肌细胞缺血再灌注损伤保护作用的信号通路(包括激活磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)蛋白激酶B(Akt)PI3K/Akt/糖原合成酶激酶(GSK-3β)即PI3K/Akt/ GSK-3β,PI3K/Akt/eNOS,ERK1/2,SOCS1/STAT3途径。通过检测分化与凋亡相关基因的表达,论述CT-1如何通过其信号通路来保护心肌细胞免受缺血再灌注的损伤。方法1、乳鼠心肌细胞培养:取出生1-3天的SD大鼠心肌组织,按改良的Simpson等方法进行分次水浴搅拌消化,差速贴壁法纯化心肌细胞,以1×106/cm2的细胞密度接种于35mm培养皿。2、缺氧复氧模型的复制:心肌细胞生长接近汇合状态,呈现同步搏动时开始实验。模拟缺血溶液( NaH2PO4mmol/L, NaHCO3mmol/L, CaCl2 1.8mmol/L, MgSO41.2mmol/L,HEPES20 mmol/L,NaCl98.5 mmol/L, KCl10.0 mmol/L,乳酸钠40 mmol/L PH6.5)以95%N2-5%CO2预饱和1h,将培养的细胞以模拟缺血液置换正常培养基,放入密闭气体盒中通95%N2-5%CO2为缺氧;置换DMEM培养基后于CO2培养箱中正常培养为复氧培养即再灌注。3、实验分组:第一节:ERK1/2,PI3K/Akt/ GSK-3β,PI3K/Akt/eNOS途径介导CT-1对心肌细胞急性缺氧/复氧损伤的保护作用根据实验方案分6组:①对照组:更换培养基后CO2培养箱中正常培养;②缺氧复氧组:缺氧3h,复氧培养3h;③缺氧复氧+CT-1组:缺氧3h后,加CT-1(10ng/ml)进行复氧3h处理;④缺氧复氧组+CT-1+ LY294002组(PIK3/akt阻断剂):缺氧3h,加入终浓度为10μmol/l的LY294002,10min后加CT-1(10ng/ml),再进行复氧3h处理;⑤缺氧复氧组+CT-1+PD98059组(ERK1/2阻断剂):缺氧3h,加终浓度为20μmol/L,10min后加CT-1(10ng/ml),复氧处理;⑥缺氧复氧组+ CT-1+ DMSO组:缺氧3h,加DMSO(助溶剂) 10min后加CT-1(10ng/ml),进行复氧3h处理。第二节:信号抑制子SOCS1/JAK介导CT-1对心肌细胞急性缺氧/复氧损伤的保护作用分别设计SOCS1蛋白基因的2条ASODN,1条正义寡核苷酸(SODN),1条错义寡核苷酸(ScODN),通过脂质体转入心肌细胞。实验分为7组(1)对照组:DMEM液培养6小时;(2)缺氧/复氧组:缺氧3h,复氧3h;(3)缺氧/复氧+CT-1组(CT-1组):缺氧3h后,加CT-1(10ng/ml)进行复氧3h处理;(4)缺氧/复氧+CT-1+ ASODN组1(ASODN组1,终浓度为20μmol/L):ASODN培养24小时后,缺氧3h,加CT-1(10ng/ml)进行复氧3h处理;(5)缺氧/复氧+CT-1+ ASODN组2(ASODN组2,终浓度为20μmol/L):ASODN培养24小时后,缺氧3h,加CT-1(10ng/ml)进行复氧3h处理;(6)缺氧/复氧+CT-1+ SODN组(SODN组,终浓度为20μmol/L):SODN培养24h后,缺氧3h,加CT-1(10ng/ml)进行复氧3h处理;(7)缺氧/复氧+CT-1+ ScODN组(ScODN组,终浓度为20μmol/L):ScODN培养24h后,缺氧3h,加CT-1(10ng/ml)进行复氧3h处理。4、检测指标:(1)相差显微镜检测心肌细胞形态,搏动频率和节律。(2)MTS法测定心肌细胞的存活率,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡,全自动生化分析仪测定上清液LDH、CPK-MB含量。(3)四氯四乙基苯丙咪唑基羰化青碘化物(JC1)荧光显微镜和流式细胞仪检测心肌细胞线粒体膜电位Δψm;二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH CA)流式细胞仪检测心肌细胞活性氧(reactive oxygen species ,ROS)。(4)RT-PCR法检测心肌细胞eNOSmRNA、iNOSmRNA、SOCS1 mRNA、Id3 mRNA和BadmRNA表达。(5)蛋白免疫印迹(Western blot)检测NADPH氧化酶复合物亚单位nox-1蛋白、PI3-K和PI3-K磷酸化蛋白水平,ERK1/2蛋白和磷酸化蛋白水平;GSK-3β蛋白和磷酸化GSK-3β蛋白水平;SOCS1蛋白水平。结果第一节1、心肌细胞搏动频率与节律:各组基线心肌细胞搏动频率均为148次/分左右,各组无明显差异,节律规整。缺氧-复氧后心肌细胞搏动频率较缺氧前明显减慢,搏动幅度减弱,节律不规整。CT-1处理组搏动频率与缺氧复氧前比无明显减慢,与对照组相近,节律整齐。而阻断剂LY294002和PD98059干预后,频率明显减慢,搏动幅度减弱,节律明显不规则,而助溶剂DMSO并不干扰CT-1的作用。表明LY294002和PD98059均特异性阻断了CT-1对缺氧复氧氧损伤的心肌细胞的保护作用。2、心肌细胞的损伤:对照组心肌细胞存活率为96.2±3.2%,凋亡率为2.8±0.4%。缺氧-复氧损伤后心肌细胞存活率明显降低,为76.8±4.6%,心肌细胞凋亡率明显上升(19.4±2.3%),二者差异有显著性意义(P<0.05),心肌酶LDH和CK-MB较对照组升高。CT-1处理的心肌细胞,明显抑制LHD、CK-MB的升高和凋亡的增加,存活率较缺氧复氧组明显升高(89.8±8.3%VS 78.8±4.6%, P<0.05), LY294002和PD98059组干预后,均明显阻断了CT-1的作用,心肌细胞存活率较CT-1组下降,而心肌细胞凋亡率增加。3、细胞内ROS水平和nox-1蛋白表达:缺氧-复氧后心肌细胞ROS水平和nox-1蛋白表达明显高于对照组(14.28±1.42 VS 3.54±0.16;1.127±0.107VS 0.215±0.018,P<0.01), CT-1处理后心肌细胞ROS水平和nox-1蛋白表达较缺氧复氧组下降(6.73±0.21VS 14.28±1.42, 0.394±0.036 VS 1.127±0.107, P<0.05),接近空白对照组。加LY294002和PD98059阻断剂干预后ROS水平和和nox-1蛋白表达则明显增加。而DMSO组ROS水平和nox-1蛋白表达与CT-1组相当。表明CT-1抑制细胞内ROS的生成,且与抑制nox-1蛋白水平有关。4、心肌细胞线粒体膜电位Δψm:流式细胞仪结果:缺氧复氧组心肌细胞Δψm明显小于对照组(86.28±7.15 VS 40.55±4.25,p<0.01),CT-1组较缺氧复氧升高(69.13±6.84 VS 40.55±4.25, p<0.05),加LY294002和PD98059阻断剂后Δψm水平则小于CT-1组(分别是50.13±5.82VS 69.13±6.84, 54.51±6.62 VS 69.13±6.84, p均<0.05),而DMSO组与CT-1组类似。荧光显微镜结果:当线粒体膜电位破坏时,JC1不能聚集到线粒体内,以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光,荧光强度与Δψm损伤程度成正比。正常细胞中,它在线粒体中形成聚集体,发出强烈的红色荧光。缺氧复氧损伤组心肌细胞绿色荧光强度明显强于对照组,而红色荧光则明显弱于对照组,表明线粒体Δψm受到破坏。CT-1处理的心肌细胞JC1绿色荧光强度明显减弱,红色荧光增强。LY294002和PD98059阻断剂处理后,心肌细胞Δψm下降,绿色荧光强度增强,红色荧光减弱。表明缺氧复氧损伤心肌细胞Δψm受损,CT-1能够阻止缺氧复氧引起的心肌Δψm细胞损伤,而信号阻断剂能阻止CT-1的作用。4、心肌细胞iNOS和eNOSmRNA表达:对照组iNOSmRNA水平较低,缺氧/复氧损伤后心肌细胞iNOSmRNA明显高于对照组, eNOSmRNA表达则低于对照组,二者差异有显著性意义(0.932±0.088 VS 0.117±0.053;0.347±0.023 VS 0.965±0.063,P均<0.05)。缺氧后CT-1处理的心肌细胞iNOSmRNA水平较缺氧复氧组显著降低,eNOSmRNA表达上调(0.359±0.027VS 0.932±0.038 ; 0.756±0.059VS 0.347±0.023 P<0.05),LY294002和PD98059组干预后,心肌细胞iNOSmRNA表达增加,eNOSmRNA表达下调,与CT-1组比较均有显著性差异。而助溶剂DMSO组与CT-1组无明显差别。5、心肌细胞PI3K蛋白和磷酸化PI3K蛋白水平:各组PI3K蛋白表达无明显差异,但磷酸化PI3K蛋白水平缺氧复氧组较空白对照组增加(0.475±0.032 vs0.325±0.018,P<0.05),CT-1组较缺氧复氧组显著升高(0.986±0.093 vs0.475±0.032,P<0.05),加PI3K/Akt阻断剂后PI3K蛋白水平明显下降(0.197±0.029 vs0.986±0.093,P<0.01),而助溶剂组和PD98059组与CT-1组无明显差异(0.963±0.048 vs0.986±0.093, P>0.05),表明CT-1激活了PI3K途径,而PI3K/Akt和ERK1/2途径在此实验未发现有交互作用。6、心肌细胞磷酸化ERK1/2蛋白水平:各组缺氧复氧后心肌细胞ERK1/2蛋白表达差异无统计学意义。缺氧复氧组较空白对照组磷酸化ERK1/2蛋白表达有所增加(0.495±0.043 vs0.249±0.016,P>0.05),但无统计学差异,而CT-1组较缺氧复氧组显著增加(0.975±0.068 vs0.495±0.043,P<0.05),加ERK1/2阻断剂后ERK1/2蛋白水平明显下降(0.127±0.011 vs0.975±0.062,P<0.05),而助溶剂组与CT-1组无明显差异(0.925±0.063 vs0.975±0.062,P>0.05)PI3K/Akt阻断剂组与CT-1组无明显差异(0.969±0.059 vs0.975±0.062, P>0.05),表明CT-1有促进缺氧复氧心肌细胞ERK1/2磷酸化的作用。7、心肌细胞GSK-3β蛋白表达和磷酸化状态:各组经3小时缺氧,3小时复氧后,心肌细胞GSK-3β蛋白表达差异无统计学意义。但缺氧复氧组较空白对照组磷酸化GSK-3β蛋白表达明显减少,而CT-1组较缺氧复氧组显著上升,加PI3K/Akt阻断剂后磷酸化GSK-3β蛋白水平明显少于CT-1组,而助溶剂组和ERK1/2阻断剂组与CT-1组无明显差异,表明CT-1有促进缺氧复氧心肌细胞GSK-3β磷酸化的作用。PI3K/Akt阻断剂可以抑制CT-1处理所引起的GSK-3β磷酸化,而ERK1/2阻断剂则无此作用。8、心肌细胞BadmRNA和Id3mRNA表达:缺氧复氧组心肌细胞BadmRNA表达明显高于对照组(0.986±0.035 VS 0.325±0.023,P<0.01),而Id3mRNA变化不明显,;CT-1处理组的BadmRNA表达较缺氧复氧组组下调(0.313±0.019 VS 0.986±0.035, P<0.05),Id3mRNA表达较I/R组稍有所下降,但无统计意义。两种信号通路阻断剂均能明显抑制CT-1的这种作用。第二节1、SOCS1介导CT-1对缺氧/复氧心肌细胞损伤:各组基线心肌细胞搏动频率均为150次/分左右,各组无明显差异,节律规整。缺氧复氧后心肌细胞搏动频率明显减慢,搏动幅度减弱,节律不规整。心肌细胞存活率明显降低,凋亡率明显增加。CT-1处理组搏动频率与缺氧复氧组比明显加快,与对照组相近,节律较整齐。两组反义SOCS1干预后,频率明显减慢,搏动幅度减弱,节律明显不规则;与CT-1组比较,心肌细胞存活率下降,心肌细胞凋亡率增加,LDH和CPK-MB增加;正义SOCS1和错义SOCS1并不干扰CT-1的作用。2、SOCS1介导CT-1对心肌细胞内ROS水平和线粒体膜电位Δψm的影响:缺氧复氧损伤后心肌细胞ROS水平明显升高(14.28±1.42VS 3.54±0.56, P<0.001), CT-1组心肌细胞ROS水平较缺氧复氧损伤组下降(4.73±0.48VS 14.28±1.52, P<0.01),接近空白对照组。两组反义SOCS1干预后ROS水平均明显高于CT-1组( 10.8±0.85VS 4.73±0.48,9.92±0.93 VS 4.73±0.48, P<0.05),而正义和错义SOCS1则对CT-1的作用无影响。流式细胞仪结果示:缺氧/复氧损伤组心肌细胞Δψm明显小于对照组,CT-1组较缺氧复氧组升高(69.13±6.84 VS 40.55±4.25, p<0.05),加反义SOCS1干预后Δψm水平则小于CT-1组(51.32±5.75VS 69.13±6.84;47.18±5.01VS 69.13±6.84, p<0.05)。正义SOCS1和错义SOCS1组结果与CT-1组类似。荧光显微镜结果:缺氧复氧损伤组心肌细胞绿色荧光强度明显强于对照组,表明线粒体膜转运孔mPTP受到破坏。CT-1预处理后心肌细胞JC1绿色荧光强度明显减弱,反义SOCS1干预后,心肌细胞Δψm下降,绿色荧光强度增强。而正义SOCS1和错义SOCS1组结果与CT-1组类似。3、反义寡核苷酸(ASODN)对SOCS1蛋白及mRNA表达的影响:缺氧复氧组较空白对照组SOCS1 mRNA表达和SOCS1蛋白水平有所增加;而CT-1组SOCS1 mRNA表达和SOCS1蛋白水平均较缺氧复氧组显著升高,表明CT-1促进心肌细胞SOCS1过表达。SOCS1反义寡核苷酸干预后SOCS1mRNA和蛋白水平较CT-1组明显下调,而SOCS1正义寡核苷酸和SOCS1错义寡核苷酸组与CT-1组无明显差异。表明转染的反义SOCS1能有效地抑制缺氧复氧心肌细胞SOCS1的表达。4、SOCS1对CT-1介导的心肌细胞磷酸化STAT3的影响:各组非磷酸化STAT3蛋白水平无明显差异。但缺氧复氧组较空白对照组磷酸化STAT3蛋白表达明显增加(0.672±0.034 vs0.147±0.012, P<0.05),而CT-1组较缺氧复氧组显著下降(0.425±0.035 vs0.672±0.031,P<0.05),加SOCS1反义寡核苷酸后磷酸化STAT3蛋白水平明显增加,而SOCS1正义寡核苷酸组和错义寡核苷酸组与CT-1组无明显差异,表明SOCS1抑制CT-1引起的STAT3磷酸化。结论1、CT-1对心肌细胞损伤的作用:减轻缺氧-复氧诱导的心肌细胞的损伤,表现在心肌细胞存活率增加,凋亡率减少,心肌细胞搏动有力且有节律,减少心肌损伤酶的释放。2、CT-1减轻心肌缺氧复氧损伤的机制:(1)通过抑制NADPH氧化酶复合物亚单位nox-1mRNA的表达,减少心肌细胞ROS的产生;(2)增加eNOSmRNA表达,减少iNOSmRNA表达;调控NO的合成,抑制心肌细胞凋亡;(3)减轻心肌细胞线粒体膜孔电位Δψm的损伤,改善心肌细胞线粒体膜转运孔的功能。3、CT-1减轻心肌缺氧复氧损伤的信号传导:(1)激活PI3K/Akt/GSK-3β途径;(2)激活PI3K/Akt/eNOS途径;(3)激活细胞外信号调节激酶ERK1/2途径;(4)激活信号抑制子SOCS1途径,抑制STAT3的磷酸化。4、CT-1通过激活以上信号通路,抑制促凋亡基因BadmRNA表达,减少缺氧-复氧损伤的心肌细胞的凋亡。