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先天性人巨细胞病毒(HCMV)感染是导致出生缺陷的最常见病因,主要引起中枢神经系统(CNS)发育紊乱。先天性HCMV发生在早孕期,其后果常常比感染发生于孕晚期更严重,表现为严重脑损伤,包括小脑畸形等。胎脑中HCMV感染最常见区域为室管膜下区(SVZ),其中细胞的主要类型是神经干/前体细胞(NPCs)。因此,建立和应用NPCs模型体系来研究先天性HCMV导致神经发育畸形机制。在以往的研究只用的NPCs源于单一胚龄脑组织、且传代低于9代(P9),而HCMV在源于不同胚龄、不同个体、培养不同时间的NPCs的感染特性上是空白。基于感染发生于早孕期造成的临床脑损伤更严重,以往的体外研究发现NPCs为HCMV感染的容许性细胞,我们推测,源于早期胚龄脑组织的NPCs的敏感性不同与(高于)后期胚龄的NPCs,体外培养和传代可能会影响NPCs对HCMV感染敏感性。
本研究首先从不同孕期的新生的死胎的胎脑组织中分离NPCs。对分离培养的NPCs经免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western blotting)等方法鉴定所分离的NPCs。用HCMV分别感染不同来源的早、中、晚胚龄的NPCs,早、晚期代数细胞的NPCs,研究和比较病毒感染后CPE进程、病毒基因表达和病毒释放水平等感染指标。结果表明:NPCs鉴定发现NPCs的标志蛋白GFAP、SOX2和Nestin等在我们所分离的干细胞中很好表达。在形态学和NPCs标志分子的表达水平上各胚龄来源的NPCs完全一致,早期代数(P3-P9)的NPCs胞体较小,伪足细长,GFAP、SOX2和Nestin表达水平一致,不同胚龄间无差异;晚期代数(P11-P20)的NPCs胞体较大,伪足较短,不同胚龄间亦无差异;但早、晚期代数间在细胞形态学和NPC标志分子表达水平有明显差异。HCMV分别感染不同来源的早、中、晚胚龄的NPCs,早、晚期代数细胞的NPCs,发现CPE发生、病毒基因的表达和病毒颗粒的释放与与我们前期的结果一致;CPE进程、病毒基因表达和病毒释放水平在不同胚龄NPCs间无差异;感染在早期代数(P3 vs.P6,P3 vs.P4) NPCs间存在着微小的差异,但差异无显著性;感染在早期(P3,P4)与晚期代数(P11,P12)NPCs间,病毒的感染指标有显著性差异。
本研究采用荧光定量PCR(real time qPCR)和免疫印迹(Western blotting)的方法,对早期和晚期代数的NPCs的标志蛋白(GFAP、SOX2、Nestin、DCX)以及病毒的受体(EGFR、PDGFR-α、ITGB3)等的mRNA和蛋白水平进行了检测,结果发现晚期代数的NPCs中GFAP的mRNA和蛋白水平均有显著性上升,说明晚期代数的NPCs有向着星型胶质细胞分化的趋势;HCMV感染受体PDGFR-α、ITGB3表达升高,且病毒侵入实验发现病毒进入晚期代数的NPCs更快、效率更高,进一步说明晚期代数的NPCs对HCMV的允许性更高可能与病毒表面受体有关。研究表明:不同胚龄来源的NPCs无明显差异,晚期代数的NPCs对HCMV的允许性更高,同时也暗示,胎脑感染HCMV在后期更易引起严重的神经损伤,造成严重的后遗症。