前言及目的卵巢原发性恶性肿瘤中，60％～90％是上皮性癌。肿瘤细胞减灭术和以铂类为基础的化疗是卵巢上皮癌的主要治疗原则。但随之而来的肿瘤细胞耐药问题使相当一部分患者在手术和化疗后仍会出现疾病进展或复发，致使其5年生存率不到30％，成为病死率最高的妇科恶性肿瘤。研究已经证实，细胞凋亡受阻在肿瘤的发生、发展中起着重要作用。大部分凋亡过程最终都将通过蛋白激酶效应物caspase。凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)是新近发现的一类细胞内凋亡抑制蛋白家族，在许多物种中发挥阻滞细胞凋亡的作用。IAP家族中以X染色体连锁的IAP(XIAP)抑制caspase的活性进而抑制细胞凋亡的强度最大，XIAP既通过BIR结构域抑制caspase活性，也通过RING结构域催化caspase泛素化降解，此外，XIAP还可通过NF-κB和多种信号转导途径阻止多种因素诱导的细胞凋亡。XIAP为普遍表达蛋白，除存在于人体的大多数组织中外，在多数癌细胞系中也有表达。XIAP基因的高表达与多种肿瘤的发生、发展及不良预后密切相关，肿瘤细胞系中高水平的XIAP蛋白明显地与一些抗癌药物的药物敏感性相关。降低或消除XIAP基因在肿瘤细胞中的过度表达，可解除XIAP对肿瘤细胞凋亡的抑制作用，促进肿瘤细胞死亡和增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指内源性或外源性与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA，在细胞内特异地降解该mRNA，从而致使特异性的基因有效封闭的过程，是一种序列特异性的转录后基因沉默。RNAi作为近年来新出现的技术以其简单快速、特异、高效、经济等特点显示出良好的应用前景。利用RNAi研究XIAP基因在卵巢癌中的作用在国外鲜有报道，国内尚未见报道。本研究即是利用RNAi技术研究XIAP基因封闭后卵巢癌细胞增殖及凋亡的变化及对顺铂化疗敏感性的变化，以逐步增加对其在卵巢癌发生、发展中作用的认识，并籍此探讨卵巢癌基因治疗的方法和途径。本论文共分三部分。第一部分，题目：卵巢上皮癌中XIAP及Caspase-3的表达及意义。目的：检测XIAP及caspase-3在卵巢上皮性肿瘤组织中的表达，分析二者间的相关性及与卵巢肿瘤细胞凋亡的关系，从而探讨XIAP、caspase-3与卵巢上皮癌发生、发展的关系。第二部分，题目：RNA干扰XIAP基因对卵巢癌细胞SKOV-3增殖及凋亡的影响。目的：合成XIAP特异性的siRNA，瞬时转染卵巢癌细胞SKOV-3，观察XIAPmRNA和蛋白的变化及对细胞增殖及凋亡的的影响。第三部分，题目：XIAP siRNA对卵巢癌细胞化疗敏感性影响的实验研究。目的：研究特异性siRNA转染卵巢癌细胞SKOV-3，XIAP基因封闭后，对顺铂化疗敏感性的影响。方法第一部分利用免疫组化(SP)法和TdT介导的dUTP的缺口末端标记(TUNEL)技术，检测15例正常卵巢组织、20例卵巢良性上皮性肿瘤和52例卵巢恶性上皮性肿瘤组织中XAIP和caspase-3蛋白的表达及细胞凋亡情况，并分析其与各种临床病理参数的关系及三者间的相关性。第二部分建立T7体外转录体系，合成特异性siRNA，用脂质体瞬时转染法介导XIAPsiRNA处理卵巢癌细胞SKOV-3后，RT-PCR检测转染后XIAP mRNA的变化，western blot检测XIAP蛋白的变化，MTT法检测细胞的相对存活率，TUNEL法及流式细胞仪检测细胞凋亡。第三部分建立T7体外转录体系，合成特异性siRNA，用脂质体瞬时转染法介导XIAPsiRNA处理卵巢癌细胞SKOV-3，再将细胞暴露于不同剂量顺铂，MTT法检测细胞的相对存活率，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果第一部分XIAP在正常组织中阳性率为26.7％，在良性卵巢肿瘤组织中阳性率为35％，在恶性卵巢肿瘤组织中阳性率为73.1％，三组之间差异有统计学意义，x~2=14.992，(P＜0.01)。XIAP在卵巢恶性肿瘤中的表达明显高于其在正常卵巢组织和卵巢良性肿瘤组织中的表达。Casapase-3在卵巢恶性肿瘤中的表达明显高于其在正常卵巢组织和卵巢良性肿瘤组织中的表达。在卵巢上皮癌组织中，XIAP的表达与caspase-3的表达及细胞凋亡指数(AI)呈负相关，caspase-3的表达与细胞凋亡指数(AI)呈正相关。卵巢上皮癌中XIAP表达与各临床病理因素无关，但随着细胞分化程度的降低，XIAP表达出现逐渐增高的趋势。第二部分特异性XIAP siRNA转染后，细胞形态变圆、折光性增强、收缩不铺展，凋亡数增多。采用RT-PCR检测各组XIAPmRNA表达显示，XIAP-mRNA的表达明显下降，并呈剂量依赖性。计数各组在转染后24h、48h、72h和96h的活细胞数显示，特异性干涉组的细胞数分别为对照组的82.71％、54.20％、60.03％、49.64％；在48h、72h和96h时间点各组活细胞数比较，特异性干涉组与其它组间的差异均有统计学意义(P＜0.01)，非特异性干涉组与空白对照组相比差异无统计学意义。MTT法检测各组细胞的吸光度值，特异性干涉组与非特异性干涉及空白对照组比较，在48h、72h和96h时间点差异有统计学意义(P＜0.05)。流式细胞仪分析XIAPsiRNA对各组细胞在干涉后各时间点的凋亡的影响显示，特异性干涉组细胞随XIAPmRNA表达下降，细胞凋亡率逐渐增加，到干涉后第六天凋亡率达最高水平，与非特异性干涉组、空白对照组比较差异显著，非特异性干涉组与空白对照组比较没有明显差异。TUNEL检测显示，特异性干涉组大量细胞出现细胞核固缩、浓聚成致密的斑点状，大小不一，形成凋亡小体等细胞凋亡的特征性改变。空白组及非特异性干涉组仅见极少的凋亡细胞，特异性干涉组凋亡指数比非特异性干涉组及空白对照组明显增高，差异显著。第三部分暴露于顺铂后，细胞存活率随顺铂浓度的增加而降低，其中，转染XIAPsiRNA组细胞减低最为显著。在给予1μg／ml顺铂后，转染XIAP siRNA组的存活率(58.23％)与转染非特异性siRNA组(65.38％)、空白对照组(68.56％)相比，有显著的差异(F=6.758，P＜0.05)，而非特异性组与空白对照组之间没有明显的差异(P＞0.05)。暴露于顺铂的各组与单独转染特异性siRNA组比较，细胞存活率明显降低(P＜0.05)。在给予1μg／ml顺铂后，采用Annexin-Ⅴ的方法检测不同时间(2d、3d、4d)细胞凋亡率的变化情况，结果显示：联合用药组细胞的凋亡率明显增加，在各时间点与单独使用顺铂及单独使用XIAPsiRNA组相比，差异显著。结论第一部分XIAP在卵巢上皮癌的发生过程中起重要作用，其机制可能为抑制细胞中caspase-3的表达，从而抑制细胞凋亡。XIAP有可能成为治疗卵巢癌的靶标之一。第二部分特异性siRNA可抑制SKOV-3细胞XIAPmRNA及蛋白的表达，并明显地抑制SKOV-3细胞的生长活性、促进SKOV-3细胞凋亡，其抑制细胞生长、促进细胞凋亡作用可能与其抑制细胞XIAP mRNA及蛋白的表达有关。第三部分特异性siRNA可以诱导卵巢癌细胞凋亡、抑制细胞增殖并增强顺铂的化疗敏感性。