γ-谷氨酰肽的酶法合成及其应用

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γ-谷氨酰肽是指含有γ-谷氨酰残基的一类小分子肽,近年来,因其具有显著的呈味效果而被广泛关注。γ-谷氨酰肽可通过γ-谷氨酰转肽反应合成,部分微生物源谷氨酰胺酶可催化此γ-谷氨酰转肽反应,因此可用于合成γ-谷氨酰肽。论文选用了三种不同微生物来源的谷氨酰胺酶,通过酶学特性对它们催化γ-谷氨酰转肽反应的能力进行了研究。将具有显著催化γ-谷氨酰转肽作用的谷氨酰胺酶用于合成γ-谷氨酰肽,并对产物的呈味特性、促胆囊收缩素分泌作用和抑制DPP-IV酶活性进行研究。实验结果如下:(1)米曲霉和解淀粉芽孢杆菌源谷氨酰胺酶具有催化γ-谷氨酰转肽作用的活性,其酶活力分别为10 U/g和100 U/g。其中,解淀粉芽孢杆菌源谷氨酰胺酶表现γ-谷氨酰转肽作用的最适pH值和温度分别为pH 10.0和37℃。此酶具有广泛的底物选择性,谷氨酰胺可作为γ-谷氨酰供体,最佳的γ-谷氨酰受体包括色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、酪氨酸等。(2)解淀粉芽孢杆菌源谷氨酰胺酶通过链式反应催化了系列γ-谷氨酰肽的合成。在谷氨酰胺和受体氨基酸存在的情况下,成功合成了系列γ-谷氨酰短肽,如γ-[Glu]1≦n≦4-Trp、γ-[Glu]1≦n≦5-Phe、γ-[Glu]1≦n≦5-Tyr、γ-[Glu]1≦n≦4-Met和γ-[Glu]1≦n≦4-Val肽等。各个酶促反应液中系列γ-谷氨酰肽的氨基酸组成特点可描述为N端聚γ-谷氨酰残基与C端受体氨基酸的结合。米氏常数测定结果显示此酶对受体的亲和力随着受体分子中γ-谷氨酰残基数的增多而降低。(3)γ-[Glu]1≦n≦5-Phe、γ-[Glu]1≦n≦5-Tyr、γ-[Glu]1≦n≦4-Met和γ-[Glu]1≦n≦4-Val肽具有显著的呈味效果。其呈味特性包括:在水溶液中呈现涩味和/或苦味;在含有基本呈味物质的溶液中具有增味作用,如使蔗糖甜味增加、味精鲜味增加和食盐咸味增加;添加到酱油或者鸡汤中可使酱油鲜味和持续感增加,使鸡汤的鲜味、浓厚感和满口味增加。这些结果表明此类γ-谷氨酰肽具有“厚味”呈味效果。此外,酶促反应液可作为风味增强剂用于酱油和鸡汤中,使酱油鲜味和持续性增加,鸡汤鲜味、浓厚感和满口感增加。(4)γ-[Glu]0≦n≦4-Trp和γ-[Glu]0≦n≦5-Phe可促进CCK的分泌。其中,γ-[Glu]2≦n≦4-Trp和γ-[Glu]3≦n≦5-Phe肽对CCK的促分泌作用与色氨酸和苯丙氨酸的促CCK分泌效果基本一致(p>0.05),且均低于γ-Glu-Trp和γ-[Glu](n=1,2)-Phe对CCK的促分泌效果(p<0.05)。说明对色氨酸和苯丙氨酸进行γ-谷氨酰基化可提高此它们对CCK的促分泌作用。γ-[Glu]0≦n≦4-Trp和γ-[Glu]0≦n≦5-Phe促CCK分泌的过程可通过CaSR-调节的Ca2+/CaM/CaMK信使通路实现。(5)通过分子模拟技术和DPP-IV酶抑制率测定结果显示γ-Glu-Met、γ-Glu-Trp、γ-Glu-Phe和γ-Glu-Tyr可通过竞争性抑制作用对DPP-IV酶产生抑制效果。通过LIGPLOT程序确定了γ-Glu-Met与DPP-IV酶结合的氨基酸残基位点和共价键类型。
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