研究背景糖尿病是临床上一种常见内分泌性疾病,它是由于多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病,是由于胰岛素分泌和(或)作用缺陷所致。持续高血糖与长期代谢紊乱等可导致全身组织器官的多种并发症,尤其是眼、肾、心血管及神经系统的慢性进行性病变、功能减退或衰竭。糖尿病的全身血管并发症分为大血管并发症和微血管并发症,糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常见的微血管并发症之一,其临床表现主要为高血压、水肿、严重蛋白尿、低白蛋白血症和进行性肾功能减退;肾脏病理主要表现为结节状或弥漫性系膜细胞增殖、基底膜((GBM)增厚,系膜细胞外基质积聚、足细胞足突融合,肾小球硬化及肾小管间质纤维化。糖尿病肾病是目前世界范围内导致终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的首位位病因,增加各国卫生保健事业支出的同时也给予社会、家庭、个人带来沉重负担。在我国糖尿病肾病发病率以及在终末期肾衰竭透析患者中所占的比例也成逐年增加趋势,严重影响了患者的生存质量。因此,探讨糖尿病肾病的发病机制、及早发现糖尿病肾病并给予适当干预治疗措施对广大糖尿病肾病患者具有重要的社会和现实意义。DN的发病机制十分复杂,涉及到糖脂代谢紊乱、炎症介质释放、血流动力学异常、细胞因子、氧化应激以及细胞凋亡等多因素的作用。近年来的研究显示,肾小球滤过屏障结构和功能的改变,尤其是作为肾小球滤过屏障重要组成成分的足细胞损伤,在糖尿病肾病的进展中发挥了举足轻重的作用,被认为是引起DN蛋白尿和肾小球硬化的关键因素。因此,研究足细胞的损伤为DN的预防和治疗带来了新的契机。足细胞又称为脏层肾小球上皮细胞,附着于肾小球基底膜外侧,与肾小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)、内皮细胞共同构成肾小球滤过屏障。足细胞的主要作用是对蛋白质的滤过及GBM成分的更新起着举足轻重的作用。由于足细胞是高度分化细胞,增殖能力较差,当足细胞受到损伤时,尿蛋白漏出增加,从而加重肾衰竭的发生,而蛋白尿又进一步加重足细胞的损伤。在DN的发生发展中,足细胞的改变主要包括足细胞数目减少,细胞凋亡增加,流动性增强,直至足细胞从GBM上脱落随尿液排出,导致GBM裸露,形成局灶粘连和肾小球硬化。DN足细胞损伤机制复杂,其不是单由某个因素所诱发,而是多个因素的联合作用。主要包括肾蛋白(nephrin)、高血糖、整合素、机械应力、炎性反应、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的激活、AGEs的蓄积、GH-胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)-I轴、血管内皮生长因子(VEGF)、类肝素硫酸蛋白聚糖(HSPG)、肿瘤抑制基因(wT1)、Podocalyxin蛋白、过氧化物酶体增殖物激活受体(perox-isome proliferatoractivated receptor,PPAR)、脂联素、微小 RNA(micro RNA,miRNA)、TGF-β1、氧化应激及细胞凋亡等。有研究显示,IQ结构域GTP酶活化蛋白1(IQdomainGTPase-activating protein 1,IQGAP1)是一种含有多个蛋白结合域的支架蛋白,近期研究发现IQGAP1在细胞黏附迁移、维持细胞形态以及调节细胞凋亡等众多生命过程中发挥了举足轻重的作用[1,2]。IQGAP1是否参与高糖诱导的足细胞凋亡尚未见报道,基于上述理论基础,我们设计并进行了本次研究。本课题分为两部分,第一步部分,采用体外培养人肾脏足细胞(HPC),观察高糖刺激对IQGAP1表达和分布以及对足细胞凋亡的影响。第二部分,进一步观察IQGAP1与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路以及肾素□血管紧张素□醛固酮系统(RAAS)在足细胞凋亡中的作用,探讨高糖诱导肾脏足细胞凋亡的分子机制,从而为更好的治疗糖尿病肾病提供理论支持。第一部分高糖刺激对足细胞中IQGAP1表达和分布以及凋亡的影响研究目的:1、观察人肾脏足细胞在体外高糖刺激下IQGAP1表达情况;2、观察人肾脏足细胞在体外高糖刺激下IQGAP1分布情况;3、观察人肾脏足细胞在体外高糖刺激下细胞凋亡情况。研究方法:HPC在33℃、5%CO2培养箱中,以含有10%胎牛血清及γ-干扰素(10 U/ml)的RPMI 1640培养液培养细胞使其增殖,传代后更换为不含Y-干扰素的RPMI 1640培养液,置入37° C、5%C02培养箱中培养10～14天,促进细胞分化成熟,用于后续实验。HPC被随机分为3组:A组:正常对照组(Normal Control,NC,)、B组:甘露醇对照组(Manitol+Glucose Control,MG)和C组:高糖组(High Glucose,HG)。NC组细胞给予D-glucose5.5mmol/L,为了控制高渗透压对细胞实验结果可能带来的影响,MG组给予D-glucose5.5mmol/L+24.5mol/L甘露醇作为对照,HG组给予D-glucose 30mmO1/L。各组细胞同步培养0、12、24、48、72小时后分别收集,应用免疫荧光法观察IQGAP1在各组环境足细胞中的表达及其分布情况,real-time PCR法检测IQGAPlmRNA在各组不同环境下足细胞中的表达情况。用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。研究结果:1、从Fig.1-1可以看出IQGAP1在足细胞的胞浆与细胞核中都有表达,但主要存在于细胞核内;2、Fig.1-2、Fig.1-3A、3B、3C显示,在0小时,正常对照组、甘露醇对照组和高糖组IQGAP1的表达量无显著性差异;在48小时,免疫荧光显示:甘露醇组与正常糖组比较,IQGAP1的表达量变化不大,差异无统计学意义,但在高糖刺激下,IQGAP1的表达水平明显下调,IQGAP1的表达量与正常糖对照组比较明显下降,差异有统计学意义;3、Fig.1-4A、B、C、D显示,流式细胞仪检测足细胞凋亡,将位于右下象限的早期凋亡细胞和位于右上象限的晚期凋亡细胞之和记录为凋亡细胞。0小时,正常糖组凋亡率1.73%±0.13%,甘露醇组凋亡率2.1%±0.15%,高糖组凋亡率2.1%±0.12%,各组凋亡率无显著性差异(P＞0.05);24小时,正常糖组凋亡率26.39%±4.57%,甘露醇组凋亡率30.44%±5.15%,高糖组凋亡率56.15%±6%;在48小时,正常糖组足细胞凋亡率37.76%±5.6%,甘露醇组凋亡率36.77%±4.27%,高糖组凋亡率68.9%±6.64%。与正常糖组比较,甘露醇组凋亡率无显著性变化,高糖组凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论:1、在正常糖组、甘露醇组和高糖组三组的足细胞培养中,IQGAP1在胞浆与细胞核中均有表达,但主要存在于细胞核内;2、高糖可以显著下调IQGAP1的表达,且随时间的延长下调表达进一步加剧;3、高糖可以显著提升足细胞的凋亡,且随时间的延长凋亡率逐渐增加。第二部分IQGAP1在高糖诱导足细胞凋亡中的作用及其机制探讨研究目的:1、通过流式细胞仪检测,观察人肾脏足细胞在体外高糖刺激下细胞凋亡情况以及探讨与IQGAP1的关系;2、通过 RT-PCR、Western blotting 观察 IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2 的表达情况,进一步探讨IQGAP1与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中p-ERK1/2、ERK1/2的关系以及在足细胞凋亡中的作用;3、观察在高糖组足细胞培养中加入贝那普利(10 μ mol/L)后IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2的蛋白表达情况以及细胞凋亡情况,进一步探讨IQGAP1与肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的作用关系,以及在足细胞凋亡中的作用;4、观察在高糖组足细胞培养中加入ERK1/2的特异性抑制剂u0126(10 μmol/L)后IQGAP1、p-ERK1/2、ERK1/2的蛋白表达情况以及细胞凋亡情况,进一步探讨IQGAP1在足细胞凋亡中的作用。研究方法:将上述在培养箱中培养10～14天后成熟HPC随机分为5组(A-E组):A组:正常糖对照组(5.5mmol/Lglucose,NC)、B组:甘露醇对照组(24.5mmol/L甘露醇+5.5 mmol/L glucose,MG)、C 组:高糖组(30 mmol/L glucose,HG)、D 组:贝那普利组(30 mmol/L glucose+10 μmol/L benazepril)、E 组:u0126抑制剂组(30 mmol/L glucose +10 μmol/L u0126)。各组细胞同步培养Oh、12h、24h、48h、72h时后收集,应用免疫荧光法观察IQGAP1在各组环境足细胞中的表达及其分布情况,real-time PCR、Western blotting 检测 IQGAPlmRNA及蛋白在不同环境下足细胞中的表达情况。通过Western blot法检测ERK1/2和P-ERK1/2的含量。用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。研究结果:1、HG抑制了 IQGAP1的表达,增加P-ERK1/2的表达,并且促进了 HPC的凋亡;2、贝那普利可以减轻高糖引起的IQGAP1抑制,上调IQGAP1的表达,下调P-ERK1/2水平。48小时,D组凋亡率50.54%±6.25%,比C组凋亡率68.9%±6.64%明显下降,差异有统计学意义,说明贝那普利可以减轻引起高糖引起的HPC的凋亡;3、U0126对高糖引起的IQGAP1的抑制没有影响。48小时,E组凋亡率3.19%±1.68%,比C组凋亡率68.9%±6.64%明显下降,提示U0126可显著减少HPC的凋亡率。结论:1、高糖通过下调IQGAP1的表达、增加p-ERK蛋白表达,促进HPC细胞的凋亡;2、贝那普利可上调IQGAP1的表达,减轻高糖诱导的细胞凋亡;3、U0126抑制剂可减轻高糖引起的足细胞凋亡,但对高糖引起的IQGAP1的抑制没有影响;4、IQGAP1通过与ERK1/2MAPK信号通路、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)相互作用,参与了足细胞的凋亡,对糖尿病肾病的进展起到一定作用。