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1.背景和目的冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD）,主要是由动脉粥样硬化引起的,而内皮损伤是动脉粥样硬化的危险因素。目前的治疗包括危险因素的控制和经皮冠状动脉介入治疗（PCI）。但是PCI后部分病人会发生管腔再狭窄,因此需要新颖的治疗策略。内皮祖细胞（EPCs）,从起源包括脾和骨髓,能归巢至损伤血管局部,分化为内皮细胞,表明内皮祖细胞有血管修复的作用。但是,涉及EPCs属性调节的基本机制仍然不确定。Schlafens（Slfns）（睡眠因子）是一类高度保守的蛋白,可控制T细胞的发育和成熟,并在过度表达时损害T细胞的增殖和活化。据报道,Slfn5可以调节涉及RCC迁移的基质金属蛋白酶（MMP）基因的表达,例如MMP-1和MMP-13。由此可见,Slfn5是一个具有极其重要功能的蛋白,对其进一步研究有着重要的意义。而我们的前期研究发现,Slfn5在大鼠EPCs有表达,其是否参与调节EPCs的作用,目前仍不清楚,因此,我们提出假设Slfn5可能参与EPCs增殖、迁移等生物理学形为的调节,从而影响其修复损伤血管的能力。2方法2.1脊椎动物Slfn基因家族生物信息学分析对人和小鼠Slfn家族基因的基因结构、染色体定位、表达的组织特异性、编码蛋白的理化性质进行了生物信息学分析。随后,对27个物种中的Slfn基因家族成员进行系统进化树的构建以及基因结构和保守基序分析。2.2 sh RNA-Slfn5重组腺病毒载体的构建根据Rat Slfn5基因的m RNA序列设计合成si RNA片段5个,分别克隆到p DKD-CMV-U6-sh RNA上转入大肠杆菌感受态细胞,PCR筛选转化子,阳性克隆进行测序;利用Admax系统选取目的穿梭质粒sh RNASlfn5（5）包装和扩增重组腺病毒sh RNA-Slfn5及病毒滴度测定;利用Slfn5过表达腺病毒质粒中目的基因携带Flag标签,通过Western印迹法检测Slfn5过表达腺病毒质粒与靶点质粒共转染293T细胞中Flag表达,观察靶点质粒对Slfn5表达的影响;最后用病毒感染EPCs并用绿色荧光蛋白量检测转染效率。2.3 Slfn5对EPCs增殖和迁移的影响及机制2.3.1 Slfn5对EPCs增殖和迁移的影响2.3.1.1 EPCs培养与鉴定使用密度梯度离心法分离脾脏来源的单核细胞,用ac-LDL-Di与FITCUEA-I双染色阳性的细胞被鉴定为分化的内皮祖细胞。此外,通过流式细胞术分析评估内皮细胞标记物（CD31、KDR）和祖细胞标记物（CD34、CD133、CD45）的表达。通过免疫荧光鉴定VWF、CD34、CD133的表达。2.3.1.2 sh RNA-Slfn5及Ad-Slfn5转染EPCs转染效率的测定在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,计算绿色荧光细胞所占所有细胞百分比,计算细胞转染效率;RT-PCR检测Slfn5 m RNA表达水平2.3.1.3体外细胞水平观察Slfn5对EPCs增殖和迁移的作用分离培养6-8天的大鼠骨髓源EPCs用于实验。实验分组:（1）Ad-Slfn5（Slfn5过表达组）;（2）sh RNA-Slfn5（Slfn5干扰组）;（3）Ad-control（过表达对照组）;（4）sh RNA-control（干扰对照组）;（5）control（未处理的EPCs空白对照组）将sh RNA-Slfn5、Ad-Slfn5及对应的空病毒对照腺病毒转染细胞,转染48小时后用于实验。采用CCK8法检测EPCs的增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期分布情况,transwell小室检测细胞的迁移能力。2.3.2体外细胞水平观察Slfn5调控EPCs的作用机制经过sh RNA-Slfn5、Ad-Slfn5及对应的空病毒对照腺病毒转染EPCs,转染48小时后,用Western blot以及RT-PCR检测EPCs中MT1-MMP在蛋白水平及m RNA不平的表达;2.3.3在体动物模型水平观察Slfn5对颈动脉血管损伤修复的影响雄性SD大鼠用75mg/千克戊巴比妥麻醉,用100 UI/千克肝素钠肝素化。用2Forgarty导管在左颈总动脉进行球囊损伤三次。球囊损伤后,立即经尾静脉注入事先转染Ad-Slfn5、sh RNA-Slfn5、Ad-control、sh RNA-control的EPCs以及正常的EPCs,对照组注射生理盐水。术后用青霉素预防感染。伊文氏蓝染色观察损伤后14天血管再内皮化,HE染色观察损伤后14天新生内膜的增生情况。3.结果:3.1脊椎动物Slfn基因家族生物信息学分析人Slfn家族各成员的基因结构和表达的组织分布均存在较大差异。其编码蛋白多为酸性,亲水性高。系统发育分析表明,Slfn成员聚集在四个主要谱系中,其中三个谱系有强有力的引导支持（90%-100%）。人类Slfn家族表达的组织分布结果表明Slfn5主要在转化的皮肤成纤维细胞、皮下脂肪组织、肺以及脾脏中表达。基因结构和保守基序分析显示Slfn成员基序大致相同。3.2大鼠sh RNA-Slfn5重组腺病毒载体的构建经测序验证5组目的质粒构建成功;重组腺病毒质粒sh RNA-Slfn5（1）、sh RNA-Slfn5（4）、sh RNA-Slfn5（5）可明显抑制Flag蛋白的表达;sh RNA-Slfn5病毒滴度为3.95×1010 pfu/m L;EPCs的转染效率为（85.64±2.58）%。3.3 Slfn5对EPCs增殖、迁移的影响及机制3.3.1 Slfn5对EPCs增殖和迁移的影响3.3.1.1 EPCs培养与鉴定成功分离培养大鼠骨髓源性的EPCs,呈梭形、卵圆形、多边形样生长。用UEA-I和Dil-Ac-LDL进行染色鉴定,激光共聚焦下观察,摄取Dil-Ac-LDL表现红色荧光,摄取UEA-I表现为绿色荧光,同时摄取Dil-Ac-LDL和UEA-I的细胞表现黄色荧光,即为双染阳性细胞,表示正在分化的EPCs（N>90%）。EPCs表面抗原通过流式分选鉴定CD31、CD34、CD45、KDR、CD133阳性细胞的占比分别为（99.70±3.84）%、（83.90±2.65）%、（0.80±2.82）%、（97.40±2.76）%、（81.60±2.84）%,免疫荧光鉴定VWF（88.29±2.31）%、CD34（84.90±2.15）%、CD133（83.70±2.15）%为阳性,因此被鉴定为内皮祖细胞。3.3.1.2 sh RNA-Slfn5及Ad-Slfn5转染EPCs转染效率的测定使用培养了8天左右的EPCs,转染sh RNA-Slfn5病毒与Ad-Slfn5病毒:sh RNA-Slfn5转染组Slfn5的表达与sh RNA-control组相比明显下调（sh RNA-Slfn5 vs sh RNA-control 0.598±3.564 vs 0.998±1.231）（P<0.05）,Ad-Slfn5转染组Slfn5的表达与Ad-control组相比明显上调（Ad-Slfn5 vs Ad-control23.234±2.241 vs 1.078±1.983）,证明EPCs成功转染了各质粒。3.3.1.3 Slfn5对EPCs增殖和迁移的作用用不同病毒sh RNA-Slfn5、sh RNA-control、Ad-Slfn5及Ad-control转染EPCs,并在转染后48小时,分别检测细胞增殖、迁移与细胞周期分析。使用CCK8法检测增殖结果表明,sh RNA-Slfn5组的细胞增殖能力显着升高（sh RNA-Slfn5组vs sh RNA-control组,1.63±0.05 vs 0.98±0.07,p<0.01）（n=6）,Ad-Slfn5组的细胞增殖能力显著下降（Ad-Slfn5组vs Ad-control组,1.53±0.09 vs 1.67±0.22,p<0.01）（n=6）。Transwell迁移试验结果显示:观察到转染了Ad-Slfn5病毒的EPCs迁移明显低于Ad-control组（Ad-Slfn5组vs Ad-control组,28.17±3.56个vs58.17±3.28个,p<0.01）（n=6）,而转染了sh RNA-Slfn5病毒的EPCs的迁移能力组明显大于sh RNA-control组（sh RNA-Slfn5组vs sh RNA-control组,94.33±1.89个vs 55.50±2.87个,p<0.05）（n=12）。流式细胞仪进行细胞周期分析,结果显示,与Ad-control组相比,Ad-Slfn5的过表达增加了G1期停滞的EPC的比例,但降低了G2+S期停滞的EPCs的比例。与sh RNA-control组相比,sh RNA-Slfn5显着增加了G2+S期细胞的比例。3.3.2 Slfn5调控EPCs的作用机制经培养了8天左右的EPCs,在不同处理48小时后:（1）control组;（2）Ad-Slfn5转染组;（3）Ad-control转染组;（4）sh RNA-Slfn5转染组;（5）sh RNA-control转染组,通过Western blot和RT-PCR分析MT1-MMP的水平。RT-PCR与Western blot结果显示与对照组相比,Ad-Slfn5转染可显着降低MT1-MMP蛋白和m RNA表达（m RNA水平:0.3388±0.02 vs.1.113±0.05,n=3,P<0.05;蛋白质水平:0.45±0.03vs.0.8421±0.06,n=3,P<0.05）;相反,与对照组相比,sh RNA-Slfn5转染显着增加了MT1-MMP蛋白和m RNA的表达（m RNA水平:3.56±0.34 vs.0.98±0.05,n=3,P<0.05;蛋白水平:0.97±0.12 vs 1.67±0.07,n=3,P<0.05）。3.3.3 Slfn5对颈动脉血管损伤修复的影响用sh RNA-Slfn5、Ad-control、sh RNA-control及Ad-control转染EPCs后,将其移植到颈动脉球襄损伤的大鼠模型,在14天用Evans蓝染色检测损伤血管再内皮化率,结果显示:与生理盐水组比较,移植了正常EPCs的再内皮化率较高,说明EPCs具有促进血管再内皮化的可能。（saline组vs EPCs组,11.78±4.87%vs 49.03±2.26%,p<0.01）（n=3）;sh RNA-Slfn5 EPCs组损伤血管内再内皮化增强（sh RNA-Slfn5 EPCs组vs sh RNA-control EPCs组,85.32±3.89%vs 50.12±4.12%,p<0.01）（n=3）;而过表达Slfn5的表达,再内皮化率降低（Ad-Slfn5 EPCs组vs Ad-control EPCs组,21.61±3.89%vs 51.18±3.89%,p<0.01）（n=3）。HE染色检测新生内膜厚度,结果显示:与生理盐水组相比,经正常EPCs处理的大鼠的新生内膜面积和中膜面积（I/M）比率显著降低（saline组vs EPCs组0.843±3.17 vs 0.524±2.87;n=9,p<0.05）。sh RNA-Slfn5 EPCs组损伤血管内I/M比率显著降低（sh RNA-Slfn5 EPCs组vs sh RNA-control EPCs组,0.225±1.09 vs 0.518±2.31;n=9;p<0.05）;而Ad-Slfn5 EPCs的内膜增生较多（Ad-Slfn5 EPCs组vs Ad-control EPCs组,0.923±1.89%vs 0.511±2.77,p<0.01）（n=9）。4结论:4.1 Slfn5在脾脏中表达较高;4.2 RNA干扰沉默Slfn5的表达显著促进EPCs的增殖、迁移、再内皮化能力以及新生内膜再生的能力。反之,过表达Slfn5,则抑制EPCs的增殖、迁移、再内皮化能力以及新生内膜再生的能力;4.3 MT1-MMP是Slfn5作用的下游靶点。