论文部分内容阅读
目的:小肠对饮食钙的吸收是维持机体钙平衡和骨骼健康的重要生理过程。而雌激素在人体具有重要的生理及病理意义。有研究表明,雌激素参与调节了小肠的钙吸收。然而,关于雌激素调节小肠钙吸收的机制目前尚未完全清楚。在这项研究中,我们旨在探索雌激素对十二指肠钙吸收的影响及其细胞分子机制。为临床上一些疾病的治疗提供理论依据,有重要的科学及临床意义。方法:(1)动物模型的建立。选择性成熟期(6周龄)C57BL/6J雌鼠在全麻下进行假手术和卵巢切除术。在手术两周后,将卵巢切除小鼠随机分为单纯卵巢切除术组(OVX)、卵巢切除+17β-雌二醇替代治疗组(OVX+E2),假手术小鼠为对照组(CONTROL)。OVX+E2组小鼠按每100g体重给予10.5μg 17β-雌二醇(E2)替代治疗。(2)十二指肠腔灌钙实验测定雌激素对小鼠十二指肠钙吸收的影响。(3)用免疫组化、蛋白质印迹实验(Western-blot)检测十二指肠钙转运蛋白(TRPV6、PMCA1b)蛋白的表达情况。(4)PTI高速离子成像系统检测雌激素对十二指肠上皮细胞(SCBN细胞)钙吸收的影响。(5)PTI高速离子成像系统检TRPV6、PMCA1b抑制剂对SCBN细胞钙吸收的影响。(6)PTI高速离子成像系统检测雌激素受体ERα、ERβ激动剂刺激+TRPV6、PMCA1b抑制剂刺激后SCBN细胞钙吸收的影响。(7)SCBN细胞在给予雌激素受体ERα、ERβ抑制剂刺激后,Western-blot检测TRPV6、PMCA1b的表达情况。(8)RNAi实验:构建质粒通过慢病毒转染使SCBN细胞的雌激素受体ERa、ERβ基因沉默后,Western-blot检测TRPV6、PMCA1b蛋白的表达情况。结果:(1)与对照组相比,OVX小鼠十二指肠钙吸收明显减少,给予外源雌激素刺激后可以恢复OVX小鼠十二指肠对钙的吸收(P<0.05,P<0.01)。(2)雌激素缺乏可以导致小鼠十二指肠钙转运蛋白TRPV6、PMCA1b表达降低,给予17β-雌二醇治疗可以上调小鼠十二指肠TRPV6、PMCA1b的表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)与对照组相比,实验组SCBN细胞给予17β-雌二醇刺激后其外钙内流增加,其TRPV6、PMCA1b的表达上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)与对照组相比,实验组SCBN细胞给予TRPV6、PMCA1b抑制剂刺激后,其外钙内流明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)选择性雌激素受体ERα激动剂PPT通过TRPV6增加SCBN细胞的外钙内流,而选择性雌激素受体ERβ激动剂DPN主要通过PMCA1b增加SCBN细胞的外钙内流,差异具有统计学意义(P<0.05)。(6)SCBN细胞雌激素受体基因沉默或给予雌激素受体抑制剂刺激后,发现抑制或沉默ERa会导致TRPV6表达降低,PMCA1b无明显变化;抑制或沉默ERβ后TRPV6表达降低不明显,而PMCA1b表达明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:雌激素可以促进十二指肠的钙吸收,其机制可能是通过雌激素受体ERα和ERβ对钙转运蛋白TRPV6、PMCA1b的表达及功能活性不同的调节作用进而调节十二指肠的钙吸收。这进一步阐明了雌激素调节小肠钙吸收的作用机制。