小桐子是一种具有巨大开发潜力的能源植物树种,低温是影响小桐子存活和生长的主要限制因子。我们实验室前期研究表明低温锻炼显著提高小桐子的抗冷性。已知miRNAs在植物对逆境胁迫响应与适应中起重要作用,但miRNAs如何调控小桐子抗冷性尚未见到报道。弄清小桐子低温锻炼过程中miRNAs参与抗冷性提高的分子机制,获取与抗冷性密切相关的关键miRNAs及其靶基因,有助于我们更好理解小桐子抗冷性形成的分子机制。本研究首先进行了小桐子低温胁迫下microRNAs实时荧光定量PCR内参的筛选与比较,而后分析了低温锻炼诱导小桐子抗冷性形成过程中一些重要的miRNAs基因及其对应的靶基因表达的变化,为揭示miRNAs参与小桐子低温锻炼下抗冷性形成的分子机制提供了一定的理论和实验基础。研究结果如下:1.基于以前的小RNA-seq结果,以低温处理的小桐子为材料,挑选11个候选内参基因,用实时荧光定量PCR技术检测它们在不同样本中的表达量,采用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行表达稳定性综合分析。结果表明,表达最稳定的基因是miR6448和U6,miR6448的Ct值为23左右,表达丰度适中;U6的Ct值为10左右,表达丰度高;因此,miR6448可作为小桐子低温胁迫下表达丰度适中的miRNAs qRT-PCR的内参基因;U6可作为小桐子低温胁迫下丰度较高的miRNAs qRT-PCR的内参基因。2.通过荧光定量PCR检测小桐子低温胁迫下的32个差异表达的候选miRNAs,发现除miR5284、miR5494、miR6189外,其它miRNAs的表达趋势与小RNA-seq的结果一致;检测结果表明:在低温胁迫处理期间经过锻炼小桐子幼苗中22个miRNAs的表达量高于未经过锻炼的;经过锻炼的小桐子幼苗中8个miRNAs的表达量低于未经过锻炼的;2个miRNAs的表达量在经过锻炼与未经锻炼的小桐子幼苗中无显著性差异。qRT-PCR的结果为低温锻炼诱导小桐子抗冷性形成过程中一些重要的miRNA的进一步研究提供一定的实验基础。3.通过对32个有差异表达的miRNAs进行的生物信息学分析,对其靶基因预测进行了GO富集、KEGG富集和功能归类。GO富集分析,参与脂质代谢过程的靶基因有10个,有84个基因参与蛋白质去磷酸化、信号转导和代谢过程等生物学过程;KEGG富集共获得212条pathway通路,参与植物激素信号传导的靶基因有12个,参与RNA转运的靶基因有12个,参与脂肪酸代谢的靶基因有9个,参与磷脂酶的有5个靶基因;对预测到的靶基因进行功能归类,大致分为:转录因子、蛋白激酶、磷酸酶、合酶、合成酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、还原酶、水解酶、磷脂酶、脱饱和酶。采用荧光定量PCR对小桐子低温胁迫下6个候选miRNA及其响应的与膜脂密切相关的靶基因,进行miRNA-mRNA表达模式分析,结果表明:miR5254对靶基因PLC起到负调控作用;miR5284对靶基因FAD6起到负调控作用;miR6189对靶基因FAR起到正调控作用;miR165、miR4239对靶基因PLA起到负调控作用;miR5827对靶基因FAD3起到负调控作用。4.从鉴定到的6个与低温胁迫下受miRNA调控的与膜脂密切相关的靶基因中,选取2个表达量高且变化倍数显著的基因(FAD3和FAD6),进行基因克隆、生物信息学分析及预测蛋白结构,为后续使用基因工程手段改良小桐子抗冷性提供了理论和实验基础。