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目的研究与探讨糖酵解重编程调节矽肺纤维化发生、发展的作用机制;并利用N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)和草氨酸钠(Oxamate)药理性阻断糖酵解重编程,观察抑制糖酵解途径从而减轻矽肺纤维化的作用与机制。方法选取人体煤工尘肺尸检标本以及尘肺患者血清作为研究对象;采用动式染尘系统构建矽肺大鼠模型;支气管一次性灌注Si O2悬液构建矽肺小鼠模型。选用NR8383肺泡巨噬细胞作为体外细胞培养研究材料。矽肺大鼠给予Ac-SDKP干预处理;矽肺小鼠分别给予100 mg/kg、500 mg/kg草氨酸钠干预处理。NR8383肺泡巨噬细胞予以Si O2诱导刺激并分别给予小干扰RNA(si RNA)-Ldha、Ac-SDKP以及乳酸(Lactate)和草氨酸钠处理。HE和天狼星红染色,观察煤工尘肺患者、大鼠和小鼠肺组织病理形态学变化和胶原沉积情况;免疫组织化学和免疫荧光染色观察肺组织乳酸脱氢酶A(LDHA)表达及其与CD68共定位表达,单核细胞趋化蛋白1(MCP1)与LDHA、精氨酸酶-1(Arg-1)与LDHA在NR8383细胞中共定位表达。免疫印迹检测I型胶原(Col I)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、糖酵解关键酶[己糖激酶2(HK2)、M2型丙酮酸激酶(PKM2)和LDHA]在动物肺组织和NR8383细胞中表达,以及巨噬细胞活化相关因子[一氧化氮合酶(i NOS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、Arg-1、白介素-10(IL-10)和MCP1]在NR8383细胞中的表达。实时荧光定量PCR检测Hk2、Pkm和Ldha m RNA在动物肺组织中的表达;免疫组织/细胞化学、免疫荧光染色和/或免疫印迹检测磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(p-PERK)、磷酸化肌醇激酶1(p-IRE-1α)和磷酸化真核起始因子2α(p-e IF-2α)在小鼠肺组织和/或NR8383细胞中的表达;乳酸脱氢酶(LDH)比色法检测尘肺患者和大鼠血清中LDH酶活性;乳酸比色法检测大鼠肺组织和NR8383细胞培养基中乳酸浓度;二氯荧光素(DCFH-DA)荧光探针法检测NR8383细胞内ROS水平;Seahorse细胞外通量分析仪检测NR8383细胞能量代谢情况,包括细胞外酸化率(ECAR)和氧气消耗速率(OCR)。结果1煤工尘肺尸检肺组织内可见煤(矽)肺形态学上动态病理演变过程,即巨噬细胞性肺泡炎、细胞性结节、细胞纤维性结节、纤维性结节、玻璃样变性结节。同时可见尘斑(灶)气肿和尘性弥漫间质纤维化。在矽肺大鼠与小鼠肺内,可见典型的细胞性与细胞纤维性结节形成,结节内含有纤维条索状胶原分布。2基于课题组前期高通量转录组测序,在筛选出与大鼠矽肺相关差异m RNAs表达结果基础上,绘制了糖酵解关键酶m RNA表达谱,发现一些糖酵解关键酶,如Hk2、Gapdh、Pgk1、Pgam1、Eno1、Ldha在矽肺大鼠肺组织中表达上调。3 LDHA在煤工尘肺病变巨噬细胞中和矽肺大鼠、小鼠矽结节内强阳性表达;在煤工尘肺则以巨噬细胞性肺泡炎区域尤为明显,在大鼠与小鼠矽肺模型中主要定位于矽结节内,且LDHA与CD68在病变区巨噬细胞内有共定位表达。与对照组比较,在大鼠、小鼠矽肺模型组,糖酵解关键酶HK2、PKM2、LDHA蛋白和m RNA表达上调,以及Col I、α-SMA蛋白表达上调。在矽肺小鼠模型组中,p-PERK、p-IRE-1α在矽结节内阳性表达增强,Col I、LDHA、p-PERK、p-IRE-1α和p-e IF-2α蛋白水平上调。在煤工尘肺患者(壹期、贰期和叁期)和矽肺大鼠血清中LDH酶活性升高。4在Si O2诱导的NR8383肺泡巨噬细胞中,糖酵解关键酶、巨噬细胞活化相关因子表达增强,乳酸含量增加,且呈一定的剂量依赖性。此外,p-PERK、p-IRE-1α和ROS的阳性表达随Si O2或乳酸诱导浓度的增加而增强,p-PERK、p-IRE-1α和p-e IF-2α蛋白表达亦呈剂量依赖性升高。沉默Ldha能抑制巨噬细胞活化,减少乳酸含量和ROS生成。这些结果提示,糖酵解重编程参与了矽肺纤维化进程,促进了矽肺病变的形成与进展。5在矽肺大鼠模型中,给予Ac-SDKP干预时,矽结节内LDHA荧光表达明显减弱,肺组织乳酸含量明显降低,血清中LDH酶活性降低。同时,Col I、α-SMA,糖酵解关键酶和巨噬细胞活化相关因子表达水平明显下降。在巨噬细胞培养模型中,给予Ac-SDKP处理能显著减少Si O2引起的LDHA/MCP1与LDHA/Arg-1共表达,并抑制巨噬细胞活化相关因子表达,减少乳酸含量和ROS生成。提示Ac-SDKP能够通过靶向阻断巨噬细胞糖酵解重编程,拮抗矽肺纤维化。6与矽肺模型组比较,100 mg/kg与500 mg/kg草氨酸钠均能减少矽肺小鼠肺内矽结节数量、面积和胶原沉积程度,降低肺组织内Col I、LDHA、p-PERK和p-IRE-1α蛋白表达,其中500 mg/kg草氨酸钠干预效果更为显著。在巨噬细胞培养模型中,给予草氨酸钠干预处理,能够降低Si O2或乳酸介导的p-PERK、p-IRE-1α和ROS阳性表达增强以及高水平ECAR和乳酸含量,并升高低水平的OCR。提示,草氨酸钠通过阻断糖酵解代谢,抑制巨噬细胞活化和内质网应激(ERS),发挥抗矽肺纤维化作用。结论1在矽肺纤维化进程中伴随糖酵解代谢的异常激活。2 Ac-SDKP通过抑制Si O2介导的糖酵解代谢增强和巨噬细胞活化,而发挥其拮抗矽肺纤维化的作用。3草氨酸钠通过靶向干预LDHA,抑制Si O2介导的巨噬细胞糖酵解代谢和ERS的增强,从而阻抑矽肺纤维化的进展。图70幅;表5个;参285篇。