登革热是由登革病毒（DENV）引起的一种急性传染病，是全球热带及亚热带地区主要的公共卫生问题，对人类健康和公共卫生安全构成了重要威胁。登革热需要借助实验室诊断才能确诊，通过RT-PCR方法检测DENV-RNA，是一种快速、敏感、特异的实验室诊断方法，其常用的检测标本为血标本，但存在病毒血症期短，采集血标本有创、不方便等缺点，尿液较血标本有经济、方便、安全无创等优点，尿液中DENV-RNA检测能否用于登革热的确诊？国外研究很少，国内尚无研究。因此，明确尿液中DENV-RNA检测对登革热确诊的价值，对于提高登革热的诊治水平有重要意义。一、研究目的本研究拟建立一种通过尿液检测DENV-RNA的实验室方法，并探讨其临床意义。二、对象1.实验组：2013年8-11月广州市第八人民医院收治的57例登革热住院病人，其中登革热（DF）42例，重症登革热（SDF）15例。采集病人73份血浆和病程早中晚期的158份系列尿液标本开展实验研究。1.157例登革热病人平均年龄为37.5岁（7-74岁）。男性有35例，女性有22例。1.273份血浆对应51例登革热病人（人均1-2份），在病程早期（发病1-5天）、病程中期（发病6-9天）和病程晚期（发病10-14天）分别有35份，33份，5份血浆；还有6例病人未采集到血浆。1.3158份尿液对应57例登革热病人（人均2-3份），在病程早期、中期和晚期分别有56份、76份和26份尿液。2.对照组：包括非登革热病人组和健康人组各10例，每人各有1份尿液标本，共20份。非登革热病人组包括艾滋病病人组5例，乙肝病人组5例。三、方法1.确诊登革热患者查阅病历资料，对57例登革热病人的临床表现及病原学检测结果进行汇总，依据2009年WHO颁布的《登革热诊断、治疗以及防控指南》，可判断57例登革热病人均达到实验室确诊标准，并可区分DF患者和SDF患者。2.标本的收集与保存2.1.采集尿液，每份留取5-10ml，在2h内以2000转/分离心10min，取上清液分装至1.5ml微量离心管中，-80℃冰箱中保存，避免反复冻融；2.2.采集新鲜抗凝血5ml，迅速分离血浆，分装至1.5ml微量离心管中，-80℃冰箱中保存。3.采用ELISA检测血浆中抗DENV-IgM和IgG抗体使用澳大利亚PanBio公司生产的PANBIO DENGUE IgM CAPTUREELISA试剂盒和PANBIO DENGUE IgG CAPTURE ELISA试剂盒，分别检测登革热病人急性期血浆中的抗DENV-IgM和IgG抗体。3.登革热病人初次感染和二次感染的判断若抗DENV-IgM阳性同时抗DENV-IgG阴性，可判断为初次感染；若抗DENV-IgG阳性，且标本采集的时间处于发热期，无论抗DENV-IgM结果如何，可判断为二次感染。5.采用RT-PCR方法检测尿液和血浆中DENV-RNA将一管尿液标本从-80℃冰箱取出，室温溶解后混匀，用1ml移液器取出200ul尿液标本至无菌微量离心管中，依照达安核酸提取试剂盒和达安RT-PCR试剂盒操作步骤，制备RT-PCR反应体系，再用7500Fast Real-time PCR system（美国ABI公司）扩增登革病毒核酸特异片段，依据扩增曲线和CT值，判定出阴阳性结果。血浆中DENV-RNA检测需要标本量、试剂盒及操作步骤，与尿液中DENV-RNA检测相同。6.肾损害的评估方法通过国内公认的结合患者的性别、年龄、血肌酐、白蛋白、血尿素氮等几个指标，并根据中国人的饮食校正专用软件，计算内生肌酐清除率，当内生肌酐清除率小于或等于70ml/min，可判断存在肾损害。7.统计学方法SPSS13.0软件，Pearson卡方检验，连续性校正法，Fisher确切概率法。P值小于0.05有统计学差异。四、结果1.血浆中抗DENV-IgM和抗DENV-IgG检测结果抗DENV-IgM阳性的有51例，抗DENV-IgG阳性的有8例。2.初次感染和二次感染的判断结果初次感染病人有43例，二次感染病人有8例。余6例病人没有收集到血浆，无法判断初次感染和二次感染。3.尿液中DENV-RNA检测结果3.1.尿液中DENV-RNA检测阳性率57例登革热病人行尿液DENV-RNA检测，40例病人出现阳性，阳性率为70.2%。对照组20份尿液中DENV-RNA检测结果均为阴性。3.2.不同发病天数尿液中DENV-RNA检测结果发病第1天，尿液中DENV-RNA检测阳性率为0（N=0/0）；发病第2天，尿液中DENV-RNA检测阳性率为0（N=0/0）；发病第3天，尿液中DENV-RNA检测阳性率为60%（N=3/5）；发病第4天，尿液中DENV-RNA检测阳性率为56%（N=10/18）；发病第5天，尿液中DENV-RNA检测阳性率为61%（N=19/31）；发病第6天，尿液中DENV-RNA检测阳性率为50%（N=12/24）；发病第7天，尿液中DENV-RNA检测阳性率为80%（N=16/20）；发病第8天，尿液中DENV-RNA检测阳性率为67%（N=14/21）；发病第9天，尿液中DENV-RNA检测阳性率为45%（N=5/11）；发病第10天，尿液中DENV-RNA检测阳性率为67%（N=6/9）；发病第11天，尿液中DENV-RNA检测阳性率为29%（N=2/7）；发病第12天，尿液中DENV-RNA检测阳性率为67%（N=4/6）；发病第13天，尿液中DENV-RNA检测阳性率为0（N=0/2）；发病第14天，尿液中DENV-RNA检测阳性率为50%（N=1/2）。结果显示，最早在发病第3天能检测到病毒核酸，最长发病第14天能检测到。除了发病第9天、第11天和第13天外，尿液中DENV-RNA检测阳性率均高于50%。其中在发病第7-8天尿液中DENV-RNA检测阳性率最高，为73.2%（N=30/41）。3.3.病程早中晚期尿液中DENV-RNA检测结果在病程早期、中期和晚期，尿液中DENV-RNA检测阳性率分别为57.1%、61.8%和50%。结果显示在病程中期尿液中DENV-RNA检测阳性率较高。4.尿液与血浆中DENV-RNA检测结果对比4.1.尿液与血浆中DENV-RNA检测阳性率比较血浆中DENV-RNA检测阳性率为96.1%（N=49/51），尿液中DENV-RNA检测阳性率为70.2%（N=40/57），P值等于0.000（Pearson卡方检验），统计学有显著差异，结果显示尿液中DENV-RNA检测阳性率较血浆低。还有6例未采集到血浆标本的病人，尿液中DENV-RNA检测均为阳性，结果显示尿液中DENV-RNA检测可以作为一种实验室诊断方法的补充。4.2.不同时段尿液与血浆中DENV-RNA检测结果比较4.2.1.血浆与尿液中最长分别在发病第12天、第14天检测出DENV-RNA。4.2.2.在病程早期，血浆中DENV-RNA检测阳性率（100%）高于尿液（57.1%），两者比较，P值等于0.000（Pearson卡方检验），有统计学差异。在病程中期，发病第7天尿液中DENV-RNA检测阳性率高于血浆。在病程晚期，未收集到血浆标本的前提下，尿液中DENV-RNA检测可作为确诊的手段。4.3.血浆阴性病人尿液中可检测到DENV-RNA有1例血浆中DENV-RNA检测阴性的病人，尿液中DENV-RNA检测阳性。有1例病人在发病第12天，血浆中DENV-RNA检测阴性，而尿液中DENV-RNA检测阳性。5.分析尿液中DENV-RNA检测阳性率的相关因素5.1.DF和SDF与尿液中DENV-RNA检测阳性率关系DF和SDF患者，尿液中DENV-RNA阳性率分别为76.2%和53.3%，两者比较，P值等于0.183，无统计学差异。结果显示尿液中DENV-RNA检测阳性率与DF和SDF无关。5.2.初次感染和二次感染与尿液中DENV-RNA检测阳性率的关系初次感染和二次感染的登革热患者，尿液中DENV-RNA检测阳性率分别为67.4%，75%，两者比较，P值等于0.994，无统计学差异。结果显示尿液中DENV-RNA检测阳性率与初次感染和二次感染无关。5.3.肾损害与尿液中DENV-RNA检测阳性率的关系有肾损害的病人只有42.9%出现尿液中DENV-RNA检测阳性，而尿液中DENV-RNA检测阳性的病人只有22.2%存在肾损害。结果显示尿液中DENV-RNA检测阳性率与肾损害无关。五、结论1.登革热患者尿液中可检测出DENV-RNA，在病程中期检测阳性率最高。2.用RT-PCR方法检测登革热病人尿液中DENV-RNA，是一种方便、经济、安全的实验室诊断方法。