研究目的近年肾细胞癌发病率在男性恶性肿瘤中位居第7,作为泌尿系统常见肿瘤之一发病率以每年2-4%的幅度递增。外科手术对于大多数肾细胞癌患者而言是最主要的治疗方式,它在早期肾癌患者中已取得很好的疗效,但对多数肾癌患者而言,切除肾脏原发灶后,影响患者生存率和死亡率的主要因素仍然是肿瘤的复发和转移。而且肾癌对放化疗敏感性较差,5年生存率在发生转移后降至5-10%。因此,进一步探索新的抗肾癌手段,增强机体抗肿瘤的能力,具有极为重要的意义。T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子3(TIM-3)作为免疫球蛋白超族成员,在完全分化的Th1淋巴细胞上高表达,同时也是Th1 CD4+细胞的特异性细胞标志物。已有研究表明TIM-3可以抑制IL-2和γ-IFN的产生,从而加速肿瘤细胞的扩散;同时在部分肿瘤(胃癌、大肠癌等)患者及动物的CD4+、CD8+T淋巴细胞上大量表达的TIM-3还能发挥负向调节T细胞免疫应答的作用,诱导T淋巴细胞的功能减弱及凋亡,进而削弱机体抗肿瘤免疫能力。但是TIM-3在肾癌患者中起到何种作用,其对肿瘤患者的哪些免疫细胞有调节作用,其具体机制如何,目前尚未见报道。一个生物群体中同时和经常存在两种或两种以上的不连续的变异型或基因型或等位基因被称为多态性,单核苷酸多态性是最常见的多态性类型之一。基因多态性在临床工作中的重要意义在于被用于分析人体对疾病、毒物等的易感性和耐受性、疾病临床表现多样性及对药物治疗反应性等。目前关于TIM-3的多态性表现已有文献报道,但是关于其与肾癌易感性之间的相关性如何未见报道。本课题基于上述原因拟研究TIM-3多态性与肾癌易感性之间的关系,同时探讨不同肾癌分期患者体内TIM-3的分布情况、TIM-3与不同分期肾癌患者Th1、CD4+、CD8+Treg、Breg等免疫细胞功能的关系,探讨TIM-3参与细胞免疫调节的作用及机制,进一步明确不同分期的肾癌患者体内TIM-3所起的作用是否不同,为探索新的治疗肾癌的方法充实理论基础。研究方法第一部分:本实验首先收集322名肾癌患者和402名健康人的血液,主要运用聚合酶链式反应-限制片段长度多态性分析技术,对TIM-3基因多态性中最常见的三种类型(即-1516G/T,-574G/T和+4259T/G)进行基因分型,据此评估在中国人群中,TIM-3多态性是否和肾癌的易感性存在有关性。第二部分:在实验的第二部分,我们收集了30名肾癌患者的肿瘤组织标本及外周血,同时采集来自10名健康体检人群的外周血标本作为实验对照,使用流式细胞术、实时定量PCR等技术,研究TIM-3在TIL CD4+T细胞和TIL CD8+T细胞上的表达及功能情况,用于明确TIM-3在肾癌中对肿瘤浸润淋巴细胞发挥的作用。第三部分:我们收集了8名I、II期肾癌患者与7名III、IV期肾癌患者的肿瘤组织标本及外周血,统计肿瘤大小及有无远处转移等情况,通过细胞分离、ELISAs及T细胞增殖和促炎性细胞因子检测等方法,分别研究外周血及肿瘤组织的各类细胞中,IL-10+细胞的分布情况、肿瘤浸润淋巴细胞中IL-10分泌型B细胞的表型、肿瘤浸润型B细胞中抗体的分泌情况、肿瘤组织中IL-10分泌型B细胞的免疫抑制功能及其与TIM-3和肾癌临床进展的相关性。结果1.第一部分(1)-574G/T和+4259T/G单核苷酸多态性在肾癌患者中的发生率明显高于对照组,而-1516G/T SNP单核苷酸多态性的发生率没有统计学差异。同时,-574G/T和+4259T/G等位基因在肾癌患者中也明显增加。(2)TIM-3-574G/T和+4259T/G SNPs互相之间具有较强的LD,而-1516G/T和-574G/T,或者-1516G/T和+4259T/G之间没有LD,肾癌患者中TTG的单体型的发生率明显高于对照组。(3)与未发生转移的患者相比,转移患者中+4259T/G等位基因的发生率明显增加,然而这些多态性在糖尿病和肿瘤组织学类型中并没有显示出任何差别。2.第二部分(1)TIM-3在肾癌患者的TIL CD4+和TIL CD8+细胞上的表达显著升高了,而且与肿瘤分期具有一定的相关性;(2)在TIL TIM-3(+)细胞上,GATA-3和IFN-γ表达下调了,而T-bet的表达上调了。此外,研究结果显示TIM-3阳性CD8+T细胞的STAT5的磷酸化水平较TIM-3阴性对照组降低了60.5%,同样的,与TIM-3(-)相比,p38在TIL TIM-3(+)CD8+T细胞中的磷酸化水平下降了30.6%,这些结果提示在肾细胞癌中TIM-3阳性肿瘤浸润性T细胞的Stat5和p38信号通路受损;(3)使用s TIM-3处理过TIL CD4+T和CD8+T细胞后,其中的CFSE细胞的百分比显著提高,这一结果表明阻断TIM-3通路可以强化TIL增殖。此外,TIL CD4+T和CD8+T细胞中IFN-γ水平在加入s TIM-3后显著上调,提示这些细胞的免疫功能因TIM-3的表达被阻断而提升。3.第三部分(1)我们分别对循环型和肿瘤浸润型淋巴细胞中的T细胞(CD3+)和B细胞(CD19+)分型进行检测,流式分析结果显示均有IL-10分泌型细胞的存在。IL-10+的细胞相对分布在T细胞、B细胞和其它(非T或非B)这三种细胞分型中因病人不同而有所区别,但是与循环淋巴细胞相比,IL-10阳性细胞在肿瘤浸润型细胞的B细胞中的相对分布值更高。我们还比较了肿瘤浸润型淋巴细胞与外周血淋巴细胞中的IL-10+细胞,发现IL-10阳性细胞在肿瘤浸润型淋巴细胞中所占比例显著上调。在总淋巴细胞或T细胞、B细胞中,未发现外周血IL-10阳性细胞频率和肿瘤浸润型IL-10阳性细胞频率之间存在相关性;(2)我们对外周血对照组和肿瘤浸润型淋巴细胞进行比较,发现IL-10在肿瘤浸润型淋巴细胞中的分泌水平显著提高,且肿瘤组织中的IL-10分泌型B细胞的相对贡献率,即IL-10分泌型B细胞与IL-10分泌型T细胞的相对比值显著提升;(3)对非IL-10分泌型B细胞和IL-10分泌型B细胞进行比较,发现IL-10分泌型B细胞表达CD19和CD20明显呈现低水平,同时也缺乏Ig M和Ig D的表达,而CD27的水平却呈现提高。在未受刺激的情况下,与自体同源的外周血B细胞相比,肿瘤浸润型B细胞上清液中Ig G和Ig A的浓度更高。尤其是,与外周血相比,在肿瘤组织中Ig A的相对浓度(Ig A在总适应性免疫抗体Ig G+Ig A中的占比)显著升高;(4)对肿瘤浸润型B细胞进行检测发现IL-10阳性细胞的频率与分泌IFN-γ和TNF-α的肿瘤浸润型T细胞的频率之间存在负相关性,同时TIM-3在IL-10阳性肿瘤浸润型B细胞高表达的病人中的表达也上调了。分别使用肿瘤浸润型B细胞上清液和外周血B细胞上清液培养T细胞,并检测两组间IFN-γ分泌水平和T细胞增生水平,结果显示肿瘤浸润型B细胞上清液培养T细胞IFN-γ分泌水平和T细胞增生水平显著降低;(5)IL-10分泌型B细胞频率和切除的肿瘤组织大小之间存在正相关性,而且III期+IV期肿瘤与I期+II期肿瘤相比,IL-10分泌型B细胞频率出现明显提高。此外,III期+IV期肿瘤与I期+II期肿瘤之间分泌IL-10的肿瘤浸润型B细胞的频率的差别不是由性别造成的。结论本研究首次证明了TIM-3 SNPs和单体型增加了中国人肾细胞癌发生的风险,同时+4259T/G SNP与肾细胞癌的转移密切相关。在肾癌肿瘤组织中,TIM-3的表达水平对T细胞的功能紊乱有指向作用,且对于免疫细胞的细胞因子分泌以及杀灭肿瘤细胞有明显的抑制作用。IL-10分泌B细胞作为成浆细胞中的崭新细胞亚型,对T细胞产生免疫抑制作用,而TIM-3则可能是B细胞的一个主要作用途径,即B细胞通过上调T细胞中TIM-3表达这一过程,抑制了T细胞的功能,并进而导致肿瘤免疫逃避的效果。以上结果为将TIM-3作为肾细胞癌可能的治疗途径提供了理论依据,预示着抗TIM-3抗体在将来可能成为一种新型的治疗肾细胞癌的免疫疗法,为肾癌的免疫治疗提供一种新的潜在选择。