糖尿病是威胁人类健康的主要疾病之一,其确切发病机制仍不清楚。长期慢性高血糖可导致心脑血管疾病的发生,如冠心病,脑卒中,血管性痴呆以及周围血管病(主要指四肢)等。研究认为糖尿病是脑血管病的独立危险因素。糖尿病发病机制包括胰岛素抵抗、糖基化终产物增多、氧化应激损伤、炎性刺激以及微循环障碍等。长期高血糖作用会导致颅内微血管结构和功能异常。糖尿病对于颅内微血管损害的影响,尤其是血脑屏障结构与功能方面的影响研究较少。血脑屏障由颅内微血管内皮、星形胶质细胞、周细胞、神经元及血管外基质构成的神经血管单元。血脑屏障的重要性,在于保障血液和脑组织之间的正常代谢物质的交换,阻止非需要物质的进入,从而维持脑的正常功能。P-gp(P-glycoprotein),是ATP结合盒子蛋白超家族的一员,分子量170KD,持续表达于血脑屏障,在维持中枢神经系统与血液循环之间的平衡方面具有重要作用。目的:本实验通过建立糖尿病大鼠模型,用HE染色、透射电镜观察糖尿病对脑血管损伤的形态学变化和血脑屏障上P-糖蛋白表达的变化,从结构与功能两个方面来探讨高血糖对于中枢神经系统损伤的发生发展的病理机制,为今后进一步研究高血糖对脑功能损伤机制的研究奠定科学依据。方法:1动物分组:将体重在180～200g之间的健康清洁级Sprague-Dawley大鼠,随机分成实验组45只,对照组30只。各组标号后,对照组随机分为2个亚组每组15只和实验组45只,按体重因素又随机分为3个亚组每组15只。2模型制备:实验组大鼠造模前一天晚上停止进食,12小时后测空腹血糖完毕后按55mg/kg体重给予2%STZ腹腔内注射,腹腔注射后恢复食物供给并于72小时后监测血糖。连续三天监测血糖,血糖>16.7mmol/L或连续两天空腹血糖>11.1mmol/L可以认定造模成功。3组织病理学样品制备:10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔麻醉动物,4%多聚甲醛溶液经血流固定后,将整个脑组织切片,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,组织切片,HE染色,光学显微镜下观察颅内微血管结构。4透射电镜样品制备:10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔麻醉动物,以含4%多聚甲醛和2.5%戊二醛的0.01%mol/L PBS作为灌注液,经血流灌注后切取1mm×1mm×2mm大小的大鼠皮层、海马部位脑组织浸入4%的戊二醛溶液中固定、1%锇酸后固定,梯度丙酮脱水,Epon812环氧树脂浸透、包埋,半薄切片定位后制备超薄切片,醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色。电镜下观察BBB结构完整性。5免疫组织化学染色:10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔麻醉动物,经4%多聚甲醛溶液血流灌注固定确实后切取大鼠脑组织片,石蜡包埋,做5μm冠状位切片,血清封闭,加P-gp一抗,经二抗,三抗孵育,DAB显色,苏木精复染,脱水透明,中性树胶封片,光学显微镜下观察P-gp表达情况。结果:1组织病理学与电镜超微结构观察:1.1组织病理学观察(HE):通过观察不同时间点(2、4、6、8、10周)的糖尿病大鼠皮层及海马部位BBB内皮并与对照组相比较,我们发现实验组与对照组大鼠BBB在内膜连续性,光滑程度无明显差异,即二者无明显变化。1.2电镜超微结构通过电镜下BBB血管内皮超微结构的观察,我们发现糖尿病大鼠2周时即可观察到内皮肿胀,随着发病时间的延长,(海马≥10周,内皮≥8周)可以发现毛细血管的内皮不连续改变。1.3免疫组织化学染色:随着糖尿病病程的延长,BBB内皮P-gp的表达随实验时间延长而减少,通过统计学分析实验组与对照组内皮P-gp含量差异具有统计学意义P<0.01。结论:1我们的实验结果发现,糖尿病确实可以对血管系统的结构与功能造成损害。即使在血糖升高的早期阶段,也可以产生血管损害,如内皮细胞的水肿。血糖升高的早期(如<2周),就可由电镜下观察到实验组与对照组之间血脑屏障内皮形态变化,随着病程的延长,电镜下可以观察到更为明显的内皮形态变化,甚至可以见到毛细血管的连续性中断。然而,从第2周直至第10周,实验组与对照组之的HE切片,在光镜下观察仍无明显差别。这一实验结果提示我们,糖尿病所致的微血管病变远较我们所能目测到的损害要早。也警示我们尽早防治糖尿病的重要性。2我们通过免疫组织化学的方法证实了糖尿病时血脑屏障内皮细胞上分布的P-gp随病程的延长,含量是减少的,证明糖尿病可以下调BBB上P-gp的表达。鉴于后者在BBB所具有的功能特性:保持脑内环境的稳定,推测糖尿病患者所具有的智能下降的等并发症可能与P-gp的减少有关。