目的：1.制备检测和参比双延迟线型漏声表面波传感器，采用相位、频率及延迟时间等多种检测方法，并比较各方法之间的优缺点。 2.探索并优化液相中Na+浓度、pH值等多种因素对漏声表面波生物传感器液相检测系统的影响。 3.利用扫描隧道显微镜观察传感器裸金膜表面、探针固定、核酸杂交过程中生物分子与金颗粒之间的微观变化。 4.通过实验研究，初步构建出新型漏声表面波生物传感器液相检测系统。 方法：1.利用精细微加工方法制备双延迟线型漏声表面波传感器，并自行开发研制自激式振荡电路，labview相位、频率记录分析软件，将它们与网络分析仪、频谱分析仪及计算机联用以构建LSAW生物传感器检测系统。 2.分别以相位、频率两个指标检测传感器液相检测反应的一致性。 3.探索不同pH值和不同Na+离子浓度对传感器的影响，探讨双通道传感器受外界条件影响的一致性及最佳反应条件的摸索。 4.用巯基末端修饰共价结合法将人乳头瘤病毒的探针固定在漏声表面波生物传感器的金膜表面，并观察其与靶序列杂交的反应，采用相位、频率和延迟时间作为检测方法，并比较不同方法的优缺点。 5.在同一传感器的金膜表面固定相同浓度的探针并与已知浓度的互补靶序列进行核酸杂交，实验条件相同，传感器再生使用10次。每次实验结束后分别用piranha液、1MHCL和1MNaOH等溶液清洗传感器反应区域，探讨漏声表面波基因传感器的再生性。 6.利用扫描隧道显微镜观察探针固定时传感器裸金表面、固定不同浓度巯基化探针、单纯加入靶序列以及巯基化探针和靶序列杂交后的金膜表面结构的微观变化。 结果：1.选择Y方向切割36°旋转、X方向传播的LiTaO3晶体，正面抛光、背面打毛处理。在其上表面光刻两个单相单向换能器(SinglePhaseUnidirectionalTransducer，SPUDT)，构成低损耗延迟线型传感器，传感器结构采用单基片双路延迟线结构。 2.自行研制的双通道振荡电路，在液相中起振非常容易，其相位/频率稳定度达到实用要求，双通道传感器在气相和液相中很稳定，两通道的一致性很好。 3.基频是100MHz、金膜电极厚度在40nm的LSAW传感器芯片最有利于核酸杂交检测。 4.自行研发的labview相位、频率记录分析软件具有自行设置各初始参数，实时记录相位/频率变化，具有自动绘制相位/频率变化趋势图及分析结果等多项功能，采集、分析后的数据自动输入到计算机。 5.双通道LSAW传感器相位检测时，两个通道变化量的相对差值比较一致；对延迟时间测量时，结果也类似。 6.两通道声发出的表面波信号的相位差值随溶液离子浓度、pH值的增大而发生明显的变化。当pH7.6、Na+浓度0.2M时是传感器进行核酸杂交的最佳反应条件。 7.相位和频率两种检测方法较好，尤其是鉴频方法检测双通道LSAW传感器的灵敏度约是压电石英谐振式体波传感器的20倍。 8.使用传感器进行最后一次核酸杂交引起的相位变化值和平衡时间均与第一次相比，变异系数较小，说明LSAW传感器再生性较好。 9.扫描隧道显微镜下可以看到裸金膜表面金原子排列有序，而固定上1.0μM、2.0μM探针后，可见金膜表面探针分子在视野内分布的密度逐步增加，间距缩小。金膜表面只覆盖1.0μM靶序列时，金原子依然排列有序，但与裸金膜及固定探针时有所不同。固定1.0μM探针后与1.0μM靶序列杂交时，扫描图像可见寡核酸分子密度更为密集，分子明显延长，分布较为均匀。 结论：1.传感器的检测系统制备成双延迟线型结构，即在同一块LiTaO3晶体上同时镀制检测、参比两路延迟线，其中参比延迟线是为了减低非特异性物质的吸附。LiTaO3晶体为Y方向切割36°旋转、X方向传播LSAW。每个通道由一个漏声表面波延迟线振荡器构成，叉指换能器的设计采用的是两个单相单向换能器(SPUDT)结构，收发叉指换能器之间是反应区域。 2.高频集成运算放大器通过延迟线型谐振器共同构成正反馈回路，进而产生高频振荡信号，双通道振荡电路的设计和优化使LSAW传感器能够在液相中更稳定地工作。 3.利用LabVIEW软件进行人机界面和仪器控制及数据处理等后台程序的编制，然后通过GPIB仪器控制卡向网络分析仪传送命令同时从仪器获取测试数据并记录在计算机上，同时以图形曲线的方式显示在显示器上。 4.将上述组件组合在一起所构建出双通道LSAW传感器液相检测系统，为后续实验搭建了坚实的技术平台，相信也可以为临床上病原微生物的检测以及多种疾病的早期诊断提供一种与常规检测方法完全不同的新方法。 5.最适合用于双通道LSAW基因传感器的基频是100MHz、金膜电极厚度为40nm。 6.成功设计出了双通道LSAW传感器，并证实两个通道对外界反应的一致性很好。 7.不同离子浓度、pH值溶液中传感器换能器发出的电信号相位的变化也各不相同。将检测通道变化的相位减去参比通道变化的相位，就是传感器除去非特异性吸附后的相位值，即两路延迟线换能器发出的电信号相位差值的变化随离子浓度、pH值的升高而不断变化。当pH7.6、Na+浓度0.2M时是传感器进行核酸杂交的最佳反应条件。 8.在加入靶序列进行核酸杂交时，检测通道和参比通道具有明显不同的相位/频率响应，由于检测通道反应区域的表面固定了特异性的HPV探针，可与加入的靶序列特异性结合，发生核酸杂交反应，相位发生明显的变化；而参比通道加入的是非特异性的PBS缓冲液，与靶序列不可能发生特异性的碱基互补结合，所以相位没有发生明显的改变。因此，将两通道的相位/频率相减，即两个通道之间的△p/△f才是真正反映因质量的吸附而引起的相位/频率的改变，通过这种差值检测技术可以有效的去除外界环境的干扰。 9.LSAW传感器再生性较好，采用piranha液、1MHCL和1MNaOH等三种溶液连续洗脱，可以将传感器反应区域固定的所有物质洗脱掉，包括探针、靶序列以及杂交后的寡核酸分子。由于LSAW传感器的叉指换能器由硅橡胶密封，以保护叉指换能器电极，因此清洗的过程都不会对传感器造成损伤。 10.扫描隧道显微镜可以形象直观的对传感器金膜表面、探针分子固定以及核酸杂交进行直接观察，结果进一步证实了我们的实验结论的正确性。