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金雀异黄素是豆科植物生长过程中产生的一类次级代谢产物,在结构上类似于动物性雌激素,具有广泛的生理功能。在哺乳动物中,金雀异黄素可以发挥抗糖尿病和抗脂肪生成的作用。然而,目前关于金雀异黄素对水产动物糖脂代谢影响的相关报道仍相对缺乏,对具体机制的研究更少。与哺乳动物相比,鱼类对于糖的需求和利用量相对较低,被认为是先天的糖尿病体质,在鱼类的养殖过程中,容易出现脂肪肝等问题。从营养学角度上,除内源因子的调节外,寻找天然的饲料添加剂调节糖脂稳态在实际生产过程中具有更重要的意义。因此,本研究通过鲤灌喂实验、养殖实验和细胞实验,共同探讨金雀异黄素对鲤糖脂代谢的调控作用。主要研究结果如下:(1)灌喂金雀异黄素对鲤糖脂代谢影响的初步探究灌喂金雀异黄素(20 mg/kg)后,鲤血清中金雀异黄素的浓度在4~8 h内达到峰值,48 h恢复到基础水平。血清中葡萄糖和总胆固醇的水平显著降低,高密度脂蛋白胆固醇的水平显著增加(P<0.05)。然而,低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯的水平显著增加(P<0.05)。此外,在肝胰脏中,金雀异黄素抑制了糖异生(fbpase)、糖原合成(gys)和脂质分解相关基因(pparα和lpl)的m RNA表达水平(P<0.05),促进了脂质合成相关基因(pparγ和fas)的表达水平(P<0.05),并且糖异生关键酶(PEPCK)和脂蛋白酯酶(LPL)的活性也显示出相似的变化(P<0.05),初步表明金雀异黄素可通过影响糖脂代谢关键酶参与鲤糖脂代谢的调节。(2)饲料中添加金雀异黄素对鲤生长、营养组成及糖脂代谢的影响饲料中添加不同浓度的金雀异黄素(0 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg、500mg/kg和1000 mg/kg)饲养鲤8周。结果发现,饲料中添加100 mg/kg或500 mg/kg金雀异黄素,显著改善了鲤的生长性能,主要表现在末体重、增重率和特定生长率的显著增加,同时在500 mg/kg添加组,肠道胰蛋白酶活性显著增加(P<0.05)。在糖代谢方面,100 mg/kg或500 mg/kg金雀异黄素添加后,血清中GLU含量下降,肝胰脏中糖酵解关键酶(gk)的表达水平增加(P>0.05),然而当添加水平达1000 mg/kg,血糖的水平显著增加(P<0.05),肝胰脏中gk的m RNA水平显著降低(P<0.05),表明100 mg/kg或500 mg/kg金雀异黄素通过降低血糖、促进糖酵解参与鲤的葡萄糖代谢。在脂代谢方面,饲料中添加100 mg/kg或500 mg/kg金雀异黄素,显著降低了全鱼的粗脂肪含量,但显著促进了鲤肌肉中总多不饱和脂肪酸(PUFA)、n-3 PUFA和高不饱和脂肪酸(HUFA)的沉积,同时增加了肝胰脏中总PUFA的水平(P<0.05)。此外,血清中TC、TG和LDL-C的水平显著降低,肝胰脏中脂肪生成相关基因(fas和srebp-1c)的表达水平显著下调,并且多不饱和脂肪酸合成相关基因,如acsl6的m RNA表达水平显著增加(P<0.05)。这表明100 mg/kg或500 mg/kg金雀异黄素可以减少脂质合成,增加脂肪分解,对鲤的营养价值也存在一定的改善作用。(3)饲料中添加金雀异黄素对鲤肠道结构及肠道菌群组成的影响饲料中补充25~100 mg/kg金雀异黄素显著增加了鲤的肠绒毛高度以及肌层厚度(P<0.05),这在鲤生长性能和肠道消化酶活性的变化中得到了验证。通过高通量测序技术发现500 mg/kg金雀异黄素添加后,鲤肠道菌群的Ace指数、Shannon指数和Simpson指数均显著增加(P<0.05),表明菌群丰富度和多样性增加。在门水平上,厚壁菌门(Firmicutes)的丰度显著增加,变形菌门(Proteobacteria)的丰度显著降低(P<0.05),表明金雀异黄素对肠道菌群组成的改善作用。在属水平上,当金雀异黄素的浓度添加到500 mg/kg,肠道中的一些有益菌,包括乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)以及鲸杆菌属(Cetobacterium)的比例显著增加(P<0.05),这表明500 mg/kg的金雀异黄素可以通过增加有益菌的比例,改变鲤肠道菌群的组成,进而对机体代谢健康有益。(4)基于AMPK信号通路探究金雀异黄素调节鲤糖脂代谢的作用机制在细胞实验中,我们首先确定1μM或10μM的金雀异黄素孵育鲤原代肝细胞,上调了糖异生相关基因(g6pase和pepck)以及glut2的m RNA表达水平(P<0.05),显著增加了脂肪分解相关基因(hsl、pparα和lpl)的表达水平(P<0.05),但抑制了脂肪生成相关基因(fas和acc-1)的表达水平(P<0.05)。在此基础上,为了探究金雀异黄素对鲤糖脂代谢调节的作用机制,在接下来的实验中,选用10μM的金雀异黄素与Compound C共同孵育鲤原代肝细胞。结果发现,Compound C孵育显著抑制了ampkα的表达水平,然而金雀异黄素上调了ampkα的表达(P<0.05)。在此基础上,进一步分析下游糖脂代谢关键基因的表达变化,发现Compound C显著下调了pfk和glut2的表达水平(P<0.05),上调了pepck的表达水平(P<0.05),并显著抑制了pparα、lpl和acc-1的表达水平(P<0.05),促进了fas、srebp-1c和pparγ的表达水平(P<0.05),然而与金雀异黄素共同孵育后,这一作用得到了显著改善,表明金雀异黄素对鲤糖脂代谢的调节可能是其激活了AMPK信号通路,从而对下游糖脂代谢相关基因的表达有一定的改善作用。综上所述,适宜浓度的金雀异黄素可以通过调节糖脂代谢关键基因来影响鲤的糖脂稳态,这种作用可能与AMPK信号通路的激活有关。并且在饲料中添加100 mg/kg或500 mg/kg的金雀异黄素可以促进鲤的生长、改善其营养组成、糖脂代谢稳态以及肠道菌群的组成。