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血红素加氧酶(Hem oxygenase,HMOX)是血红素代谢中的关键限速酶,在机体低氧胁迫代谢调控过程中扮演着重要角色。藏绵羊(Ovis aries)在长期进化过程中形成了独特的低氧适应策略以维持自身的氧平衡。为了探索血红素加氧酶家族基因(HMOX1和HMOX2)在藏绵羊低氧适应遗传机制中的作用,本研究选择藏绵羊(低氧组)和湖羊(对照组)为研究对象,测定分析了藏绵羊和湖羊血液生理指标的差异,克隆测定藏绵羊HMOX1和HMOX2基因mRNA序列并利用生物信息学方法分析其结构及功能,采用RT-qPCR及PCR-SSCP技术,对血红素加氧酶家族基因(HMOX1和HMOX2)进行组织表达分析,并对其基因进行变异位点的筛查,进而分析变异位点对藏绵羊血液生理指标性状的影响。主要研究结果如下:1.藏绵羊低氧适应的血液生理学特性研究通过分析藏绵羊(低氧组)和湖羊(对照组)十二项血液指标发现,PO2、SO2、HGB、HCT四项指标与氧的代谢运输有密切联系,其在低氧条件下,藏绵羊PO2、SO2低于湖羊(P<0.01),藏绵羊HGB、HCT高于湖羊(P<0.01),在低氧状态下机体缺氧造成血液PO2、SO2指标下降,而藏绵羊HGB和HCT的升高是为了在低氧环境下提高单位体积血液的携氧能力;pH、PCO2、HCO3-、TCO2和BE五项指标与血液酸碱平衡相关,藏绵羊PCO2、HCO3-、TCO2和BE低于湖羊(P<0.01),pH指标两种间无差异(P>0.05);Na+、K+和Ca2+为血液中电解质指标,藏绵羊Ca2+高于湖羊(P<0.05),Na+和K+两项指标在两种间无差异(P>0.05),这种差异其原因可能与藏绵羊在低氧环境下造成机体缺氧,使氧代谢放缓有关。2.藏绵羊HMOX1和HMOX2基因克隆及生物信息学分析(1)获得了藏绵羊HMOX1基因(GenBank No.MK630326)的cDNA部分序列,长度为1302bp,包括5’端非编码区(5’UTR)为15bp,3’端非编码区(3’UTR)为426 bp,编码区(CDS)序列长度为867bp,编码288个氨基酸,与绵羊序列比对发现:藏绵羊HMOX1基因的CDS区存在2个(T337C和C522T)碱基突变位点,其中T337C突变引起了第113位半胱氨酸改变为精氨酸。通过对藏绵羊HMOX1蛋白的理化性质分析表明,藏绵羊HMOX1蛋白属于跨膜亲水性蛋白。(2)获得了藏绵羊HMOX2基因(GenBank No.MH358397)CDS区全长1005 bp,编码334个氨基酸,与绵羊序列比对发现:藏绵羊HMOX2基因的CDS区存在3个(G485C,T486G和A500T)碱基突变位点,其中G485C、T486G突变引起了第162位半胱氨酸改变为丝氨酸,A500T引起了第167位的谷氨酰胺改变为亮氨酸。通过对藏绵羊HMOX2蛋白的理化性质分析表明,藏绵羊HMOX2蛋白属于跨膜亲水性蛋白。3.HMOX1和HMOX2基因在绵羊不同组织中特异表达(1)HMOX1基因在藏绵羊和湖羊各组织中均有表达,该基因在藏绵羊脾脏中高度表达(P<0.01);藏绵羊脾脏中的表达量高于湖羊(P<0.05);藏绵羊HMOX1基因在脾脏表达量与血红蛋白含量呈正相关。(2)HMOX2基因在藏绵羊和湖羊各组织均有表达,该基因在藏绵羊肺中呈高度表达,藏绵羊心、肺中的表达量高于湖羊(P<0.01);藏绵羊HMOX2基因肺脏和心脏表达量与其血红蛋白含量呈正相关。4.藏绵羊HMOX1和HMOX2基因的遗传变异及耐低氧适应性进化分析(1)HMOX1基因第1外显子-第1内含子检测到2条变异序列和4个SNPs位点,核苷酸变异与PO2、HGB和SO2指标相关,其中,存在等位基因B1的藏绵羊HGB显著提高;第2外显子检测到2条变异序列和2个SNPs位点,核苷酸变异与HCT、HGB和SO2等指标相关,其中,存在等位基因B2的藏绵羊HCT、HGB和SO2显著提高。第3外显子检测到3条变异序列和4个SNPs位点,核苷酸变异与PO2、HCT、HGB和SO2等指标相关,藏绵羊中A3A3和B3B3型个体的HGB和HCT显著高于A3B3型,A3C3型SO2显著高于A3A3和B3B3型个体;第4外显子检测到2条变异序列和1个SNPs位点,核苷酸变异与PO2和SO2等指标相关;其中,存在等位基因B4的湖羊PO2和SO2值较高,但存在等位基因B4的藏绵羊PO2和SO2值影响不大。(2)HMOX2基因第1外显子-第1内含子检测到2条变异序列和2个SNPs位点,核苷酸变异与PO2、HCT和SO2指标相关,其中,缺乏等位基因B5的藏绵羊HCT和HGB显著提高。第2外显子-第2内含子检测到2条变异序列和2个SNPs位点,核苷酸变异与HCT指标相关,其中,存在等位基因A6的藏绵羊HCT显著提高;第2内含子检测到2条变异序列和2个SNPs位点,核苷酸变异与HCT和HGB指标相关,其中,缺失等位基因B7的藏绵羊HCT和HGB显著提高;第5外显子-第6外显子检测到2条变异序列和1个SNPs位点,该区域遗传变异与PO2、HCT和SO2指标相关,等位基因B8对藏绵羊PO2和HCT指标相关(P<0.01),对SO2指标相关(P<0.05);HMOX1和HMOX2基因序列的变异使藏绵羊血液中的HCT和HGB增加,促使红细胞的携氧能力增强,可有效的缓解低氧环境下的缺氧。综上所述,HMOX1和HMOX2基因的低氧特异表达可以调节低氧代谢通路的下游血红蛋白的代谢,基因突变与血液指标有一定的相关性,可作为低氧适应的候选基因,为探索藏绵羊低氧适应分子机制提供基础数据。