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研究目的携带新德里金属β-内酰胺酶-1（NDM-1）的革兰氏阴性菌（G-）是一类对几乎所有β-内酰胺类抗生素都具有抗性的多重耐药“超级细菌”。目前,NDM-1耐药菌肆虐全球,已成为导致临床重症感染死亡的重要致病菌。而且,NDM-1耐药菌可以通过释放含有NDM-1酶和blaNDM-1耐药基因的外膜囊泡（OMV）促使耐药基因在不同菌种之间广泛快速传播,进一步加剧耐药性的全球播散,这已成为临床上难以控制的棘手难题。但目前临床上依旧缺乏针对NDM-1耐药菌的有效治疗药物,能够有效阻断blaNDM-1耐药基因播散的药物也尚属空白。因此,寻找和研发能有效控制NDM-1耐药菌感染与播散的新药物刻不容缓。Thanatin（Tha）是一种来源于昆虫的阳离子抗菌肽,业已证实Tha对多种革兰氏阳性细菌（G+）、G-和真菌均具有抗菌活性,其抗菌机理可能与影响微生物的膜结构有关。我们在前期的研究中首次发现,Tha对携带blaNDM-1的大肠埃希菌（E.coli）和肺炎克雷伯杆菌（K.pneumoniae）也表现出较强的体外杀菌活性,Tha不仅能破坏细菌的外膜结构,而且能抑制NDM-1酶的水解活性,并且Tha在亚抑菌浓度下还可以恢复NDM-1耐药菌对亚胺培南和美罗培南的敏感性。这些结果提示,Tha对于NDM-1耐药菌的抗菌机制可能不同于传统的阳离子抗菌肽,而是通过未知的独特机制发挥抗NDM-1耐药菌作用。因此,本课题将聚焦研究Tha抗NDM-1耐药菌的抗菌作用特点,揭示Tha抑制NDM-1酶活性的作用机制,探讨Tha抑制NDM-1耐药菌经OMV传播耐药性的作用与机制。阐明上述问题,将有助于明确Tha抗NDM-1耐药菌的作用新机制,探索阻断NDM-1耐药菌经OMV传播耐药性的新路径,为研究开发新型抗NDM-1耐药菌感染与播散药物提供新的研究思路和策略。研究方法1.Tha体外抗NDM-1耐药菌活性及其安全性评价从临床分离、鉴定出携带有blaNDM-1基因的E.coli和K.pneumoniae;按照药敏实验标准,采用最小抑菌浓度（MIC）法、杀菌曲线实验,评价Tha对NDM-1 E.coli和K.pneumoniae的体外抗菌活性;利用NDM-1 E.coli和K.pneumoniae分别构建小鼠败血症模型和肺炎模型,观察Tha对感染小鼠生存曲线与生存率的影响;摘取感染小鼠的肺、肝、脾等脏器,匀浆后检测各脏器荷菌数,并对上述组织行HE染色,观察组织的病理学改变;检测Tha对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人肺泡上皮细胞（HPAEpi C）和小鼠神经元细胞的细胞毒性;经腹腔给予小鼠60 mg/kg的Tha,观察大剂量Tha对小鼠生存率的影响,评价其急性毒性。2.Tha对NDM-1 E.coli胞膜渗透作用的影响利用PI（Propidium iodide）和NPN（N-Phenylnaphthalen-1-amine）荧光染料法,检测Tha作用后NDM-1 E.coli XJ141026内外膜通透性的改变;运用扫描电镜直接观察Tha对NDM-1 E.coli XJ141026外膜完整性的影响;采用Ca2+定量试剂盒及LPS检测试剂盒,检测Tha对NDM-1 E.coli XJ141026释放Ca2+和LPS的影响;通过MIC实验,观察二价阳离子、金属螯合剂对Tha抗菌活性的影响;利用等温滴定量热技术（ITC）测定Tha、Ca2+、Mg2+与LPS的亲和力,综合评价Tha是否能够与二价阳离子竞争性结合NDM-1 E.coli XJ141026外膜的LPS,破坏NDM-1 E.coli XJ141026外膜盐桥结构,进而破坏细菌外膜的完整性和稳定性;通过检测Tha处理后NDM-1E.coli XJ141026培养上清和菌体中NDM-1蛋白的水平变化,观察Tha是否可以通过破坏NDM-1 E.coli XJ141026外膜的完整性,将细菌周质内的NDM-1蛋白释放到培养上清中。3.Tha对NDM-1酶水解活性的影响利用酶标仪检测NDM-1 E.coli XJ141026培养上清对亚胺培南的水解作用,观察Tha对培养上清中NDM-1酶活性的抑制作用;运用微量热泳动仪（MST）测定Tha、多粘菌素E（colistin）、Zn2+与纯化NDM-1蛋白的亲和力,直接确证Tha与NDM-1蛋白的相互作用;通过检测纯化NDM-1蛋白对亚胺培南的水解作用变化,确证Tha对NDM-1酶的抑制作用及抑制类型;运用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）技术以及Zn2+逆转实验,验证Tha是否通过与Zn2+竞争性结合酶活性位点,发挥抑制NDM-1酶水解活性的作用;最终利用体内外联合杀菌实验,评价Tha是否可以作为NDM-1酶抑制剂,恢复亚胺培南及美罗培安对NDM-1 E.coli和K.pneumoniae的抗菌活性。4.Tha对NDM-1 E.coli OMV传播耐药性的阻断作用从NDM-1 E.coli XJ141026的培养上清中分离提取OMV,通过纳米粒度颗粒跟踪分析仪（NTA）及透射电镜检测OMV的粒径范围及形态;利用PCR及Western-Blot明确OMV中是否包裹有blaNDM-1基因和NDM-1蛋白;通过膜通透性检测实验与Western-Blot,明确Tha是否能够破坏OMV膜结构;将Tha处理后的OMV与敏感菌共孵育,通过MIC实验,检测OMV转化后敏感菌对碳青霉烯类抗生素的敏感性变化;并利用PCR及Western-Blot检测转化后敏感菌中blaNDM-1基因和NDM-1蛋白的表达水平,综合评价Tha是否可以通过破坏OMV膜结构,阻断耐药基因的传播。研究结果1.Tha具有高效的体内外抗NDM-1 E.coli和K.pneumoniae作用,且毒性较低体外实验结果显示,Tha对携带blaNDM-1基因的E.coli和K.pneumoniae均表现出较强的抑菌作用,其MIC值分别为2和8μg/m L;杀菌曲线进一步证实,Tha能够时间依赖性地杀灭NDM-1耐药菌,降低细菌数量;整体动物实验结果显示,6 mg/kg Tha能够显著提高NDM-1 E.coli所致败血症模型和肺炎模型小鼠的生存率,减少感染小鼠脏器荷菌数,保护小鼠脏器,减轻脏器病理损伤;9 mg/kg Tha能够显著提高NDM-1 K.pneumoniae所致肺炎模型小鼠的生存率,降低感染小鼠肺脏荷菌数,保护小鼠脏器,减轻脏器病理损伤;Tha对HUVEC、HPAEpi C和小鼠神经元细胞均具有较低的细胞毒性,其细胞安全性浓度是体外有效杀菌浓度的100倍以上;经腹腔给予小鼠60 mg/kg大剂量Tha处理后,小鼠15天生存率为100%。2.Tha通过与Ca2+/Mg2+竞争性结合细菌外膜的LPS,破坏外膜完整性发挥杀菌作用Tha能够依次增加NDM-1 E.coli XJ141026外膜和内膜的通透性,破坏NDM-1 E.coli XJ141026外膜的完整性;Tha能够促进NDM-1 E.coli XJ141026外膜释放Ca2+和LPS,外源性补充Ca2+能显著抑制Tha的杀菌活性及其释放LPS的能力,补充金属螯合剂则能显著提高Tha的抗菌活性;ITC检测结果显示,Tha与LPS的亲和力是Ca2+/Mg2+与LPS亲和力的100倍以上,提示Tha可能与二价阳离子竞争性结合细菌外膜的LPS,进而破坏细菌外膜的完整性和稳定性,最终导致细菌死亡;并且Tha能够通过外膜破坏作用将细菌周质中的NDM-1酶释放到培养上清中。3.Tha通过与Zn2+竞争性结合NDM-1酶活性位点,直接抑制其水解活性,并恢复碳青霉烯类抗生素对NDM-1耐药菌的体内外抗菌活性Tha能够抑制NDM-1 E.coli XJ141026培养上清中的NDM-1酶对亚胺培南的水解作用;MST结果显示,纯化NDM-1蛋白与Tha的亲和力是其与天然辅因子Zn2+亲和力的10倍;酶抑制实验证实,Tha可以直接抑制NDM-1酶的水解活性,是NDM-1酶的竞争性抑制剂;ICP-MS以及Zn2+逆转实验进一步确证,Tha能够通过与Zn2+竞争性结合NDM-1酶活性位点,发挥抑制NDM-1水解活性的作用;体内外联合杀菌实验证实,作为NDM-1酶抑制剂,亚抑菌浓度的Tha可以恢复亚胺培南及美罗培南对NDM-1 E.coli和K.pneumoniae的体内外抗菌活性。4.Tha能够有效破坏OMV的完整性,阻断blaNDM-1基因的播散从NDM-1 E.coli XJ141026培养上清中分离的OMV具有清晰的囊泡结构,粒径约为146.2 nm,且携带有blaNDM-1基因和NDM-1蛋白;膜通透性实验显示,Tha能够时间及浓度依赖性地增加OMV膜的通透性;经Tha处理后,OMV中包裹的NDM-1蛋白能迅速被外源性蛋白酶K降解,进一步佐证Tha能够破坏OMV的膜结构;OMV转化敏感菌实验证实,完整的OMV与敏感菌共孵育后,敏感菌对于亚胺培南和美罗培南的敏感性显著降低,并成功表达blaNDM-1基因和NDM-1蛋白,表明OMV是耐药性传播的重要载体;而将Tha处理后的OMV与敏感菌共孵育后,敏感菌对于亚胺培南和美罗培南的敏感性未见明显降低,且blaNDM-1基因和NDM-1蛋白在转化后敏感菌中的表达水平较低,表明Tha可以通过破坏NDM-1耐药菌的OMV,阻断耐药基因的传播。研究结论1.Tha对NDM-1 E.coli和K.pneumoniae具有较强的体内外杀菌活性,且毒性较低。2.Tha可以通过与Ca2+/Mg2+竞争性结合细菌外膜LPS,破坏细菌外膜的完整性和稳定性,最终导致细菌死亡。3.Tha通过与Zn2+竞争性结合NDM-1酶活性位点,直接抑制NDM-1酶水解活性,是NDM-1酶的竞争性抑制剂。4.亚抑菌浓度的Tha可以恢复亚胺培南及美罗培南的体内外抗NDM-1 E.coli和K.pneumoniae活性。5.Tha可以破坏NDM-1耐药菌OMV膜的完整性,导致blaNDM-1耐药基因失去传播载体,从而阻断耐药性在细菌之间的播散。