前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤。2021年《CA:ACancer Journal for Clinicians》发布的2020全球癌症统计报告显示:前列腺癌发病率占全球男性恶性肿瘤的第二位,死亡率占第五位。在我国其发病率和死亡率也呈现逐年上升的趋势。目前,雄激素剥夺疗法（androgendeprivationtherapy,ADT）是进展期前列腺癌的标准治疗方法。但是大部分患者在接受治疗12～18个月后产生激素抵抗,转为去势抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer,CRPC）。针对此阶段的患者主要治疗药物有恩杂鲁胺、阿比特龙、多西他赛等。雄激素受体（androgen deprivation,AR）在CRPC进展中起到关键作用,恩杂鲁胺以其与雄激素受体AR的超高亲和力受到医学界的广泛关注。临床研究显示,恩杂鲁胺可有效改善CRPC患者的生存预后,美国食品药品监督管理局已批准恩杂鲁胺用于治疗转移性及非转移性CRPC患者。尽管恩杂鲁胺在CRPC的治疗方面有较好的应用前景,但令人遗憾的是,患者在经过一段时间的治疗后,不可避免的产生恩杂鲁胺耐药,患者一旦出现耐药,临床常无后续积极有效的治疗手段。因此,探索前列腺癌恩杂鲁胺耐药的致病机理,寻找新颖的干预策略显得极为迫切和重要。越来越多的循证学证据显示,AR信号通路的再激活是前列腺癌细胞产生恩杂鲁胺耐药的主要分子机制,主要表现为AR的扩增、突变及剪切变异体的产生等。其中,AR-V7是AR的主要剪切变异体。我们课题组长期致力于CRPC发生发展的分子机制研究,识别到PADI2、TXNDC9等多个与CRPC进展相关的驱动基因并揭示了其致病机制。为进一步识别与CRPC进展相关性前列腺癌恩杂鲁胺耐药的驱动基因并探索其作用机制,我们通过使用前列腺癌恩杂鲁胺耐药相关数据库筛选耐药组与敏感组之间的差异基因,并结合本实验室构建的前列腺癌恩杂鲁胺耐药细胞模型检测差异基因的表达,识别到驱动蛋白家族成员15（kinesin family member 15,KIF15）可能是促进前列腺癌恩杂鲁胺耐药的关键基因。KIF15是N末端定位、正极导向的马达蛋白,参与细胞纺锤体的分离,在细胞有丝分裂以及神经轴突形成中发挥重要作用。研究显示KIF15在多种肿瘤组织中高表达并发挥促癌作用,包括胰腺癌、乳腺癌等。本研究使用生物信息学分析并结合临床组织样本、细胞模型及裸鼠荷瘤模型,从多维度揭示KIF15在前列腺癌恩杂鲁胺耐药中的作用并探讨其分子机制,为临床CRPC患者的治疗提供新思路。本研究内容主要分为两部分。第一部分KIF15促进前列腺癌恩杂鲁胺耐药:前列腺癌恩杂鲁胺耐药是临床面临的重大问题和挑战之一,识别耐药相关的驱动基因并揭示其生物学作用,可以为临床寻找积极的干预策略提供理论依据。本研究结合生物信息学及耐药细胞模型进行系统筛选,筛选出与前列腺癌恩杂鲁胺耐药相关的驱动基因KIF15,并从临床标本、细胞水平及动物水平三个不同层面探索KIF15在前列腺癌恩杂鲁胺耐药中的生物学作用,并取得了如下结果:1.恩杂鲁胺耐药细胞模型的构建形态学检测结果显示:前列腺癌恩杂鲁胺耐药细胞（C4-2B-ENZR细胞）与对照细胞（C4-2B-Parental）相比,触角变粗、变长。细胞耐药指数检测结果显示:C4-2B-ENZR细胞的IC50值是C4-2B-Parental细胞的5.75倍。与C4-2B-Parental细胞相比,C4-2B-ENZR细胞中AR、AR-V7和AKR1C3的mRNA水平及蛋白水平明显增加;在恩杂鲁胺作用下,C4-2B-ENZR的细胞活性、增殖能力、克隆形成能力明显增强。2.前列腺癌恩杂鲁胺耐药驱动基因KIF15的识别我们通过生物信息学对前列腺癌恩杂鲁胺耐药相关数据库进行分析,选取恩杂鲁胺耐药组与敏感组的差异基因中变化倍数大于1.5且P值小于0.05的基因,使用C4-2B-Parental、C4-2B-ENZR模型结合qRT-PCR技术检测差异基因的mRNA表达水平。其中,与C4-2B-Parental细胞相比,KIF15的mRNA在C4-2B-ENZR中升高最为明显。3.KIF15在前列腺癌恩杂鲁胺耐药细胞及恩杂鲁胺耐药组织中高表达多个前列腺癌恩杂鲁胺耐药相关公共数据库的分析结果显示:前列腺癌恩杂鲁胺耐药的细胞、小鼠移植瘤、患者临床标本中KIF15的mRNA表达均比恩杂鲁胺敏感组有明显升高。在细胞系水平,C4-2B-ENZR和22Rvl细胞较C4-2B-Parental细胞及LNCaP细胞中KIF15的mRNA和蛋白表达量明显增高;对LNCaP及C4-2B细胞进行长期恩杂鲁胺刺激（大于1个月）后KIF15的mRNA和蛋白表达量均显著增加。4.KIF15的高表达与前列腺癌患者不良预后相关GEO（Gene Expression Omnibus）数据库及癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）等公共数据库分析结果显示:与良性前列腺组织相比,前列腺癌组织中KIF15的mRNA表达明显增加;KIF15的mRNA表达水平与患者生化复发、Gleason评分、临床肿瘤分期呈正相关,与患者生存预后呈负相关。免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）检测发现:KIF15在前列腺癌组织（n=7）中的免疫组化表达明显强于良性组织（n=3）;而在362例前列腺癌组织中,Gleason评分较高的组织中KIF15的蛋白表达量更高。5.KIF15促进前列腺癌细胞的增殖和迁移能力MTS、EdU、平板克隆形成实验、Transwell小室实验结果显示:与对照组相比,在22Rv1、VCaP和PC3细胞中干扰KIF15的表达后,细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移浸润能力均显著下降;在LNCaP、C4-2B细胞中过表达KIF15后,细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移浸润能力均显著上调。6.KIF15促进前列腺癌细胞对恩杂鲁胺的抵抗及耐药相关肿瘤形成MTS及平板克隆形成实验结果显示:与对照组相比,在C4-2B-Parental细胞过表达KIF15后细胞对恩杂鲁胺的敏感性明显降低;在C4-2B-ENZR、22Rv1细胞敲减KIF15后细胞对恩杂鲁胺抵抗性明显降低。在C4-2B-ENZR、22Rv1细胞中稳定干扰KIF15进行皮下裸鼠荷瘤实验,结果提示稳定干扰KIF15的表达可以延缓肿瘤生长。综上所述,KIF15在前列腺癌恩杂鲁胺耐药细胞中高表达并促进恩杂鲁胺耐药细胞的增殖及肿瘤形成,KIF15的高表达与前列腺癌患者的不良预后有关。第二部分KIF15通过调控USP14介导的AR及AR-V7蛋白稳定性促进前列腺癌恩杂鲁胺耐药的发生:揭示KIF15促进前列腺癌恩杂鲁胺耐药的作用机制并寻找有效的干预策略,可以为临床治疗提供理论支持。本研究通过使用生物信息学分析和多种分子生物学实验,借助体内、体外模型在多层面进行分子机制的探索,取得了如下结果:1.KIF15与AR、AR-V7信号通路具有相关性对22Rvl和C4-2B-ENZR细胞干扰KIF15的RNAseq数据进行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）发现:雄激素诱导性基因集、AR和AR-V7激活性基因集主要富集在对照组:雄激素抑制性基因集、AR和AR-V7抑制性基因集主要富集在KIF15干扰组。qRT-PCR及Western blot检测结果显示:与C4-2B-Parental细胞相比,C4-2B-ENZR细胞中AR、AR-V7的mRNA和蛋白表达量明显增高。2.KIF15调控AR、AR-V7的蛋白表达qRT-PCR、Western blot 及 IHC 实验结果显示:在 C4-2B-ENZR、22Rv1、C4-2B-Parental及LNCaP细胞中KIF15并不影响AR、AR-V7的mRNA表达,但是KIF15可以促进AR、AR-V7的蛋白表达;稳定敲减KIF15的肿瘤组织中AR、AR-V7的蛋白表达水平与对照组相比有明显下降;在C4-2B-ENZR及22Rv1细胞中加入KIF15抑制剂（KIF15-IN-1）后,AR、AR-V7的蛋白表达下调并具有浓度及时间依赖性。3.KIF15通过调节AR、AR-V7的表达增强前列腺癌细胞增殖活性MTS实验结果显示:当20 μM恩杂鲁胺作用时,在C4-2B-ENZR及22Rv1细胞中干扰KIF15能够抑制细胞增殖,这种效果可以被AR或AR-V7的过表达逆转;在LNCaP、C4-2B-Parental细胞中过表达KIF15能够促进细胞增殖,这种效果可以被AR基因的敲低所逆转。4.KIF15与AR的N末端结构域直接结合蛋白免疫共沉淀实验（co-immunoprecipitation,Co-IP）实验结果显示:在C4-2B-ENZR、22Rv1细胞中,KIF15可以与AR、AR-V7形成复合体;GST pull-down实验证实KIF15与AR、AR-V7直接结合。在293T细胞中过表达AR截短体质粒进行Co-IP实验,结果显示:KIF15与AR的N末端结构域相结合。免疫荧光实验、核质分离结合Co-IP实验结果显示:AR-KIF15复合体主要位于细胞质中。5.KIF15抑制AR、AR-V7蛋白的泛素化降解Westernblot实验结果显示:当10μg/mL放线菌酮（cycloheximide,CHX）作用时,在C4-2B-ENZR、22Rvl细胞中敲低KIF15表达或加入KIF15-IN-1后AR、AR-V7的蛋白半衰期与对照组相比明显缩短,在C4-2B-Parental细胞过表达KIF15后AR蛋白半衰期延长;MG132可以逆转KIF15敲低引起的AR、AR-V7蛋白下调。Co-IP实验结果显示:与对照组相比,在C4-2B-ENZR和22Rv1细胞中敲低KIF15表达,AR、AR-V7蛋白的泛素化水平升高,在C4-2B-Parental细胞过表达KIF15,AR蛋白的泛素化水平降低。6.KIF15通过促进USP14与AR、AR-V7的结合维持AR、AR-V7蛋白的稳定性质谱分析结果显示:泛素特异性肽酶14（ubiquitin specific peptidase 14,USP14）与KIF15有相互作用。Co-IP检测结果显示:在C4-2B-ENZR及22Rv1细胞中,KIF15与USP14蛋白存在内源性结合;USP14与AR、AR-V7蛋白相互结合并能降低AR、AR-V7蛋白的泛素化水平。qRT-PCR 及 Western blot 实验结果显示:在 C4-2B-ENZR、22Rv1 细胞中敲低 KIF15的表达或在C4-2B-Parental细胞中过表达KIF15,均不影响USP14的mRNA及蛋白水平变化。Co-IP实验结果显示:与对照组相比,在C4-2B-ENZR、22Rv1细胞中敲低KIF15表达,USP14与AR、AR-V7的结合减少,在C4-2B-Parental细胞中过表达KIF15,USP14与AR的结合增加;此外,USP14可以逆转敲减KIF15导致的AR、AR-V7蛋白下调及其泛素化水平的增加,而失活突变体USP14（C114A）没有这种作用。7.KIF15是AR的靶基因GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn）数据库显示,前列腺癌中 AR 与 KIF15 的 mRNA表达呈正相关。qRT-PCR和Western blot结果提示:在雄激素作用下,LNCaP细胞中KIF15的mRNA及蛋白水平升高,并呈现时间及剂量依赖性;在C4-2B-ENZR、22Rv1及PC3细胞中AR促进KIF15的mRNA及蛋白表达。染色质免疫共沉淀实验（chromatin immunoprecipitationassay,ChIP）结果显示AR可以与KIF15的启动子结合。双荧光素酶报告基因检测结果显示AR可以激活KIF15野生型而非突变型的启动子活性。8.KIF15抑制剂抑制恩杂鲁胺耐药性前列腺癌细胞增殖及肿瘤形成MTS、EdU、平板克隆形成实验结果显示:在C4-2B-ENZR、22Rv1细胞中,细胞活力随KIF15-IN-1浓度升高或作用时间延长而降低,当恩杂鲁胺联合作用时细胞活力下降更为明显;KIF15-IN-1可以增加细胞对恩杂鲁胺的敏感性、抑制细胞增殖能力及克隆形成能力。裸鼠皮下成瘤实验结果显示:与对照组相比,KIF15-IN-1可明显抑制小鼠肿瘤生长,KIF15-IN-1与恩杂鲁胺联合用药后抑制肿瘤生长的效应更为显著。上述结果提示KIF15抑制剂和恩杂鲁胺协同作用可能会抑制CRPC进展。综上所述,本研究首次识别并探讨了 KIF15在前列腺癌恩杂鲁胺耐药中的作用及分子机制。KIF15可以通过USP14维持AR、AR-V7蛋白的稳定性,AR可以促进KIF15的转录,二者形成正反馈环路协同促进前列腺癌的恩杂鲁胺耐药。KIF15抑制剂与恩杂鲁胺联用为治疗CRPC提供新思路。