蓝藻神经毒素β-N-甲氨基-L-丙氨酸在太湖食物链中赋存与环境行为研究

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多数蓝藻可产生蓝藻神经毒素β-N-甲氨基-L-丙氨酸(β-N-methylamino-L-alanine, BMAA),我国多个大型淡水湖泊(滇池、太湖、巢湖)已发生严重蓝藻水华污染,因此,在我国开展水环境中BMAA毒素的调研工作迫在眉睫。本文以近年来太湖水体中受蓝藻水华污染较严重的贡湖湾为研究对象,首先改进了环境样品中蓝藻毒素BMAA的检测方法,在此基础上调查了藻华暴发初期至藻华衰亡期(4~11月)微囊藻、软体动物、甲壳动物及鱼体内两种形态BMAA的富集,探讨了蓝藻暴发不同时期内BMAA毒素在食物链上的生物富集及生物放大现象。本文还研究了蓝藻毒素BMAA在环境中的归趋行为,也探索了BMAA毒素对几种抗氧化物酶和乙酰胆碱酯酶活性的影响以及BMAA毒素与上述酶及血清蛋白的相互作用。主要研究结果如下:1.采用固相萃取结合液相色谱-串联质谱联用技术检测受蓝藻水华污染的水体中蓝藻毒素BMAA,选取Oasis MCX (Waters)固相萃取小柱,采用2%甲酸水溶液及甲醇依次淋洗,最后用5%氨水洗脱目标物,该方法能有效地富集浓缩水样中BMAA毒素,样品回收率达75%以上。采用0.1M三氯乙酸作为提取溶剂结合超声波细胞破碎法可以成功提取生物样品(蓝藻样品、底栖动物、鱼类)中游离态BMAA,盐酸水解法收集样品中蛋白结合态BMAA,上述样品衍生化后经HPLC-MS/MS检测,选用EclipseXDB-C18柱,28%乙腈水为流动相(含0.1%甲酸铵),ESI+电离模式和MRM监测模式,样品平均加标回收率达75%以上。2.在太湖贡湖湾藻华暴发初期至衰亡期(4~11月),蓝藻细胞总BMAA浓度均值范围在2.03~7.14(μg/g干重),藻华暴发期内(6~9月)其细胞内BMAA毒素的浓度最高,而在藻华暴发初期(4-5月)及藻华衰亡期(10-11月)内其细胞内BMAA浓度较低,结果表明贡湖湾水体中微囊藻能生物合成蓝藻毒素BMAA。在藻华暴发初期,微囊藻、软体动物、甲壳动物及鱼体内富集的BMAA浓度较低,均值分别为2.03、2.09、1.04和1.61μg/g干重,不同营养级生物富集的BMAA浓度无显著差异(p>0.05)。蓝藻水华大规模暴发后,微囊藻、软体动物、甲壳动物及鱼体内BMAA浓度均值分别为7.14、2.11、5.12和9.12μg/g干重,随着藻细胞BMAA浓度的增加,甲壳动物及鱼体内BMAA浓度均有显著增加,此时肉食性翘嘴红鲌鱼体内富集的BMAA毒素浓度最高(35.91μg/g干重),表明由微囊藻合成的BMAA毒素可以在不同营养级生物体内富集,且在食物链上有逐级递增的趋势。藻华衰亡期内微囊藻、软体动物、甲壳动物及鱼体内BMAA浓度均值分别为3.18、5.66、5.12和7.65μg/g干重,此时底栖动物体内富集的BMAA毒素均值浓度处于整个采样周期内均值的最高水平(5.39μg/g干重),而杂食性的鲫鱼、鲤鱼体内富集的BMAA毒素均值浓度也处于整个采样周期内均值的最高水平(11.65μg/g干重)。本研究首次发现贡湖湾水体中微囊藻合成的BMAA毒素可在食物链不同营养级上发生不同程度的富集,且在食物链上出现生物放大的现象。基于上述调查结果及已报道的BMAA毒理学数据,假设BMAA毒素的NOAEL值为0.5g/kg/d,根据WHO制定的饮用水质量指导方针所述公式推算出人类每日容许摄入BMAA毒素的TDI值为0.5mg/kg/d。软体动物、甲壳动物、鱼的EDI值(估计每天摄入量)分别为5.35、6.27和10.08(μg/kg/d),贡湖湾各级水生动物EDI均值为7.23μg/kg/d,显著低于估算出的TDI值(0.5mg/kg/d),因此,贡湖湾水域含有BMAA的水产品健康风险相对较低,但是其长期健康风险需更多的研究确定。3.湖泊沉积物对蓝藻毒素BMAA的吸附试验表明在不同温度(15℃、25℃及35℃)下灭菌与否的沉积物7天后对BMAA的吸附率均大于95%,显著高于活性炭对BMAA的吸附能力,表明不同基质对BMAA的吸附能力不同。相同温度下沉积物灭菌与否对BMAA的吸附能力无显著影响(p>0.05),表明沉积物中的微生物没有显著影响基质对BMAA的吸附能力。研究表明随着温度的升高,沉积物对BMAA的吸附能力逐渐增强。4.不同光源影响BMAA光降解速率大小依次为UVC光源>UVA光源>日光,持续光照12h后UVC光对BMAA的降解率为38.4%,而上述不同光源对蓝藻提取液中BMAA的光降解率大小依次为日光>UVC光源>UVA光源,光照12h后的降解率分别为84.8%、79.9%和61.7%,表明不同光源照射下,含有色素或光敏剂的蓝藻提取液中BMAA毒素降解速率均显著大于BMAA标准品水溶液(p<0.05)。实验选取单波长UVC光照考察光照强度、pH、温度对BMAA光降解的影响,结果表明温度是影响蓝藻提取液中BMAA降解速率的重要因素。光照强度及pH相同时,温度对藻提取液中BMAA光降解速率有显著性影响(p<0.05),BMAA光降解速率随温度升高逐渐增大。同一温度下,光照强度对藻提取液中BMAA的降解速率也有显著影响,当环境温度为15℃和25℃时(相同pH),藻提取液中BMAA的降解速率随光照强度增强而逐渐增大。在相同温度和光强条件下,碱性条件有利于藻提取液中BMAA的光降解。不同介质对蓝藻提取液中BMAA的光降解速率影响依次为0.05g/L腐殖酸>湖水>河水>超纯水,这4种不同介质中BMAA光降解速率随着光照强度的增强均逐渐增大,在最大光照强度(4.1mW/m2)时,6h内BMAA在腐殖酸、湖水、河水中的降解率均达95%以上,其中腐殖酸能显著促进BMAA的光降解。5.从太湖底泥中分离到的5种细菌(假单胞菌、丛毛单胞菌、不动杆菌、寡养单胞菌、短波单胞菌)的生长迟缓期、对数期及稳定期内均可以检测到游离态和蛋白结合态的BMAAo结果表明这5种细菌在生长过程中均可以快速吸收BMAA,吸收能力依次为寡养单胞菌>短波单胞菌>假单胞菌>丛毛单胞菌>不动杆菌,且细胞内游离态浓度均显著高于蛋白结合态BMAA浓BMAA度,但短时间内细菌对降解能力较弱。BMAA毒素与几种蛋白的相互作用实验表明6. BMAA的10μg/mL~1mg/mL均没有影响过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶及乙酰BMAA胆碱酯酶的活性,且与这几种抗氧化物酶的结合能力不强。30℃条件下BMAA与乙酰胆碱酯酶可以发生非酶促结合;30℃和pH7.5条件下,BMAA可BMAA以有效地与牛血清蛋白结合,推测可能影响游离态在生物体内的分布。BMAA
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