论文部分内容阅读
NADP-苹果酸酶(NADP-malic enzyme,NADP-ME)广泛地存在于生物体中,包括：细菌、藻类、动物和植物。在Mg2+、Mn2+二价金属离子下,NADP-ME催化苹果酸氧化脱羧生成丙酮酸、CO2、NADPH。在植物体内NADP-ME酶参与了不同的代谢途径。然而,对木本植物NADP-ME基因家族的特性及功能了解甚少。本文分析C3树木毛果杨NADP-ME(Populus trichocarpa NADP-malic enzyme,PtNADP-ME)基因家族及其特性。1、NADP-ME同源性检索表明,毛果杨基因组上存在5个PtNADP-ME基因,分别命名为PtNADP-ME1、2、3、4和5。结构域分析显示,5个PtNADP-ME家族成员均具有NADP-ME保守的结构域。PCR及DNA序列表明,PtNADP-ME家族5个基因均转录表达。进化树构建显示,PtNADP-ME家族5个成员分属于植物NADP-ME家族的3个进化分枝。2、半定量RT-PCR分析表明,PtNADP-ME家族基因在茎、叶等组织均有表达,但没有明显的组织特异性表达模式。黑暗条件下毛果杨叶片内PtNADP-ME1、PtNADP-ME4转录水平无明显变化,PtNADP-ME5转录水平稍微受到黑暗条件的影响。机械损伤下PtNADP-ME2基因转录持续升高,PtNADP-ME1、PtNADP-ME5表达没有明显的变化。在NaCl、甘露醇和PEG不同逆境胁迫下PtNADP-ME家族不同基因转录表达响应的方式不同,质体型PtNADP-ME4和PtNADP-ME5的转录表达显著地被NaCl.PEG及甘露醇3种不同处理所诱导,在NaCl处理下二者的mRNA水平持续诱导升高,而在甘露醇胁迫下随着处理时间延长二者转录水平均有所下降,但仍比对照的增加数倍。3、用大肠杆菌原核表达体系表达、纯化PtNADP-ME3和PtNADP-ME5融合蛋白,对这两种PtNADP-ME融合蛋白的最适pH值、酶活性、酶动力学常数等进行了鉴定。PtNADP-ME3、PtNADP-ME5融合蛋白最适pH值分别7.7和7.8。不同浓度的底物苹果酸、NADP对PtNADP-ME3和PtNADP-ME5融合蛋白酶活性影响呈现了不同,高浓度的底物苹果酸和NADP均抑制PtNADP-ME3和PtNADP-ME5融合蛋白酶活性。另外,TCA循环中的不同代谢物体外对PtNADP-ME3和PtNADP-ME5融合蛋白酶活性显示了激活或抑制的影响。OAA、柠檬酸强烈抑制PtNADP-ME3和PtNADP-ME5酶活性,乙酰CoA、CoA、葡萄糖-6-磷酸、延胡索酸盐,也轻微的增强PtNADP-ME3酶活性。因此,PtNADP-ME3、PtNADP-ME5体内代谢反应功能可能受到TCA循环的多种代谢物的调控。