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直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一,近年来发病率呈显著上升趋势。目前传统的治疗手段如放疗、化疗、手术等未能明显提高直肠癌患者的5年生存率。因为化疗、放疗等在治疗肿瘤的同时对正常组织亦存在损伤,使用剂量受到限制。且部分肿瘤出现对化疗及放疗的耐受也影响了其疗效。随着对结直肠癌基因研究的深入,直肠癌的各种基因治疗正逐渐受到重视。目前最有临床应用前景的基因治疗方法包括自杀基因治疗及抗血管生成基因治疗等。抗血管生成基因治疗是指应用基因表达与调控等手段抑制实体瘤的血管生长,切断肿瘤的营养供给,对肿瘤采取饥饿疗法,从而达到治疗肿瘤的目的。在这方面的研究中,Endostatin(内皮抑素)是最新发现的强有力的新生血管内皮细胞生成的抑制剂,能够抑制体内多种实体瘤的生长,已显示出广阔的临床应用前景。自杀基因系统以其多方面的优越性在肿瘤基因治疗中倍受关注,它通过直接杀伤作用及“旁观者效应”发挥抗肿瘤效应。大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)基因是继单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV2TK)后又一重要的自杀基因,与HSV2TK相比,CD基因具有更强的"“旁观者效应”及存在远距离“旁观者效应”的特点,CD自杀基因治疗(亦称分子化疗)肿瘤具有广泛的应用前景,在美国被称为最有前途的基因治疗方案。利用基因工程技术,将抗血管生成基因治疗的Endostatin基因、CD自杀基因融合,协同作用于直肠癌。鉴于脂质体转染基因具有安全性,不产生排异反应,可反复转染等优点,但不足是转染效率不如病毒载体高。如果将脂质体转染基因治疗和第三代铂类化疗药物奥沙利铂结合起来,既可以利用奥沙利铂存在的对脂质体促进转染作用,克服脂质体转染效率低下的不足,使基因治疗与化疗有机的结合起来,无疑为恶性肿瘤的治疗又增加了新的手段和方法。目的明确奥沙利铂促进脂质体对直肠癌细胞的转染效率,探讨奥沙利铂联合CD-Endostatin对直肠癌细胞的协同杀伤作用。将奥沙利铂联合脂质体转染CD-Endostatin基因对HR-8348直肠癌荷瘤鼠治疗,观察其疗效,从而为临床治疗直肠癌提供理论依据。方法一、构建含融合基因pcDNA-CD-sED质粒。二、脂质体法,体外转染含有CD基因、CD-Endostatin基因的质粒于直肠癌细胞株HR-8348,用G418(400ug/L)继续培养筛选转染阳性细胞,同时用未转染的HR-8348细胞做对照。观察对照细胞大部分死亡时,更换G418(200ug/L)维持筛选。15天后观察抗性克隆形成。获得稳定表达的克隆细胞,传染至HR-8348细胞后的阳性克隆子分别命名HR-8348CD(转染pcDNA-CD质粒), HR-8348ECD(转染pcDNA-CD-sED质粒),挑出阳性克隆,扩增培养。含绿色荧光蛋白(GFP)基因质粒转染HR-8348细胞,用奥沙利铂促转染,用GFP基因表达绿色荧光蛋白观察脂质体转染效率及奥沙利铂的促转染作用。三、Western印迹检测pcDNA-CD-sED转染不同时间后细胞裂解液中Endostatin蛋白表达。用MTT法测定转染CD-Endostatin基因阳性克隆子表达Endostatin蛋白的上清液对人脐静脉内皮细胞的抑制作用。四、MTT检测奥沙利铂联合CD-Endostatin基因对HR-8348细胞杀伤作用。五、荷瘤裸鼠的制备及分组:将HR-8348细胞0.2ml(0.5×107细胞/ml)接种于4-5周BALB/C-nu/nu裸鼠右侧后肢外侧皮下,待瘤体长至长径达0.5cm后,用随机数字法将裸鼠分为4组:(1)奥沙利铂联合CD-Endostatin基因组:通过尾静脉注入低剂量的奥沙利铂2.5mg·kg-1,应用1ml注射器对每个肿瘤于奥沙利铂作用后第0、4、8、12天多点注射(至少4个点)200ul Lipofectin- pcDNA-CD-sED复合体;第3天开始腹腔注射5-FC 500mg/kg/day,连续12天。(2)奥沙利铂联合CD基因组10只:通过尾静脉注入低剂量的奥沙利铂2.5mg·kg-1,应用1ml注射器对每个肿瘤于第0、4、8、12天多点注射200ul Lipofectin-pcDNA-CD复合体;第3天开始腹腔注射5-FC 500mg/kg/day,连续12天。(3)奥沙利铂组10只:通过尾静脉注入低剂量的奥沙利铂2.5mg·kg-1,只注射生理盐水,200ul生理盐水于第0、4、8、12天行瘤体内多点注射。(4)空白对照组:只注射生理盐水,200ul生理盐水于第0、4、8、12天行瘤体内多点注射。于治疗后28天拉颈法处死各组裸鼠。绘制荷瘤裸鼠的肿瘤生长曲线,计算瘤体积抑制率及瘤重抑制率。免疫组化染色观察肿瘤内部的新生血管密度。六、统计学处理:均数应用x±s表示,应用SPSS10.0统计软件行χ2检验和方差分析,以P<0.05为统计学显著差异。结果一、倒置荧光显微镜观察GFP蛋白显示:经奥沙利铂作用后,脂质体转染细胞的转染效率明显增强(可提高18倍左右),可利用奥沙利铂促进脂质体转染基因治疗。二、Western印迹检测pcDNACD-sED转染不同时间后细胞裂解液中人Endostatin蛋白显示:感染细胞24h后表达人Endostatin蛋白,在120h达到高峰,并持续到180h,说明Endostatin基因在HR-8348细胞获得高效及长时间的表达。CD-Endostatin基因阳性克隆子表达Endostatin蛋白的上清液对人脐静脉内皮细胞的有明显的抑制作用。三、体外试验结果显示:联合CD基因及5-FC系统能够明显增强对HR-8348细胞的杀伤效率,用IC50浓度的奥沙利铂作用,转染CD基因的HR-8348细胞实验组细胞抑制率均值为86.2%,转染CD-Endostatin基因组与单纯转染CD基因无明显差异;未转染CD基因的HR-8348细胞对照组细胞抑制率均值为48.1%,其差异有显著性意义(p<0.05)。四、荷瘤小鼠肿瘤抑制率结果显示:奥沙利铂联合CD-Endostatin基因组,奥沙利铂联合CD基因组,奥沙利铂组肿瘤生长抑制率分别为79.69%、51.67%、37.67%,奥沙利铂联合CD-Endostatin基因组较奥沙利铂治疗组、奥沙利铂联合CD基因组差异有显著性(P<0.01)。五、癌组织病理学检查结果:奥沙利铂联合CD-Endostatin基因组的肿瘤细胞数目较其它三组明显减少,肿瘤细胞呈退行性病变,核分裂相明显减少,不见瘤巨细胞,而肿瘤细胞被大量的脂肪细胞所代替。同时,奥沙利铂联合CD-Endostatin基因组可明显减少肿瘤内部的新生血管密度,其他治疗组较对照组减少肿瘤内部的新生血管密度不明显。结论1、化疗药物奥沙利铂具有提高脂质体对直肠癌细胞HR-8348转染效率的作用,应用奥沙利铂后的转染效率能接近病毒载体转染水平。2、Endostatin在体外试验中能抑制内皮细胞增生,小鼠荷瘤试验证明了Endostatin通过抑制内皮细胞增生来控制肿瘤新生血管的形成,从而达到阻止直肠癌生长及转移。3、CD-Endostatin联合基因治疗,从肿瘤治疗的两个重要方向即肿瘤细胞内靶向化疗与抑制肿瘤新生血管形成,协同发挥CD基因、Endostatin基因对直肠癌的杀伤作用。4、利用脂质体反复转染CD-Endostatin基因联合奥沙利铂治疗HR-8348荷瘤鼠,肿瘤体积抑制率为81.5%,瘤重抑制率分别为79.69%,治疗效果显著,且无明显的毒副作用。5、本实验将融合基因治疗、化疗有机的结合起来,可产生协同作用,对直肠癌治疗疗效显著,这将为治疗恶性肿瘤提供了一个很好的思路,同时也为临床治疗癌症可能提供了理论以及实践的依据。