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鸡球虫病是严重危害养禽业的一种寄生虫病，目前主要靠药物防治。近年来，由于球虫耐药性的产生及消费者对绿色食品的呼唤，人们开始寻找其它的防治措施。核酸疫苗以其可诱导产生较强的细胞免疫反应等优点而倍受青睐，已在一些传染病及肿瘤的防治上取得一定进展。球虫病对中国养禽业的危害也相当严重，为了研究核酸疫苗对球虫感染的防治效果，我们进行了如下试验： 1．球虫Et1A基因的克隆 以Eimeria tenella BJ株孢子化卵囊总RNA为模板进行RT-PCR。按照GenBank发表序列合成引物，引物上下游加上BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点，以利于插入载体中。扩增产物与pGEM-T相连接后，转化JM109感受态细胞，将经PCR和酶切鉴定正确的阳性克隆进行测序。结果表明，扩增产物大小为1978bp，ORF大小为1944bp；与Kramer等(1993)克隆基因的同源性为99.5％，有6个部位、共7个碱基发生了突变，其中5个有意义突变，2个无意义突变。与报道的E.acervulina的Ea1A基因的同源性为79.8％。推测的表达产物与核苷酸转氢酶功能相似，估计可为子孢子入侵宿主细胞提供能量。 2．TA4基因的表达及鉴定 球虫子孢子表面抗原TA4(25kDa)是通过二硫键连接8kDa和17kDa两条多肽形成的，在孢子化后期合成。E.tenella BJ株的TA4基因同国外株的同源性为99％。本试验进行了TA4基因的表达，表达产物免疫鸡后，分离血清，以为DNA疫苗的检测提供抗体。试验发现，以pGEX-KG为载体，用IPTG可诱导TA4基因在E.coli BL21 (DE3)中的表达。SDS-PAGE表明，融合蛋白大小约43kDa，而非推测的51kDa，诱导6h的蛋白表达量即可达到较高水平，表达量约为31％。采用抗GST抗体进行Western-blot，成功检测到了特异性条带。说明SDS-PAGE前的样品煮沸处理可使连接TA4两条多肽的二硫键断裂，只有17kDa的多肽可与26kDa GST蛋白结合。样品采用反复冻融法处理，加入还原型谷胱苷肽后，采用GST凝胶回收柱Sepharose 4B纯化的融合蛋白主要为51kDa的单一条带，煮沸变性后电泳，则43kDa带含量增加。说明纯化过程可影响GST-TA4融合蛋白的特性。 3．真核表达载体pCT和pCTE的构建、体外表达及其对球虫感染的防治效果研究 将TA4基因插入真核表达载体pcDNA3.1中，然后在其上游融合方式插入E.tenella BJ株的Et1A基因，构建成核酸疫苗pcDNA-TA4(pCT)和pcDNA-Et1A-TA4(pCTE)，采用脂质体介导转染COS细胞进行体外表达，并用IFAT检测，均获得成功。采用MTT法进行淋巴细胞转化试验，表明中剂量(50μg)的pCT具有较强的诱导鸡的细胞免疫反应的能力。 采用25％蔗糖局部胸肌预处理后10～15min，用核酸疫苗间隔一周两次免疫鸡，一周后采用3×10~4 E.tenella BJ株孢子化卵囊攻虫发现，pCT和pCTE对球虫感染具有明显的保护作用，可显著减轻球虫感染引起的机体增重下降。其中，重组干扰素联合核酸疫苗pCT中剂量(50μg)免疫时，鸡的增重效果最为明显，相对增重率达到108.80％，盲肠病变值也最为轻微，ACI达167.2。试验还发现，50μg pCTE可以达到100μg pCT的抗球虫效果，ACI在160以上，说明融合插入两种基因可节省一半的疫苗用量，从而降低疫苗生产成本。