KCC2、GABA_ARα1蛋白在SE大鼠海马的表达及BDNF对其的影响

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目的:观察大鼠癫痫持续状态(SE)后2周内海马KCC2及GABA_ARαl蛋白的表达,及使用BDNF中和性抗体血清(anti-BDNF)干预后其表达的变化,探讨KCC2在SE及反复自发性癫痫发作形成中的可能机制及其与GABA_ARαl的关系,及BDNF在SE发生过程中对KCC2和GABA_ARαl蛋白表达的影响。方法:25只正常大鼠随机分为假手术组、90min组、180min组、270min组和360min组,每组5只,立体定向侧脑室内注射anti-BDNF(假手术组注射正常羊血清),相应时间处死后用Western Blot检测海马BDNF蛋白的含量。健康成年雄性SD大鼠130只,随机分为生理盐水对照组(10只),SE组(60只)和干预组(60只)。利用氯化锂-匹罗卡品(LiCl-PILO)腹腔注射制作大鼠SE模型(SE组),在LiCl-PILO致痫前3h立体定向侧脑室注射anti-BDNF制作干预组模型(干预组),两组均选取SE后2h、6h、24h、3d、7d和14d为实验点。观察两组大鼠在SE诱发过程中的行为学差异,Nissl染色观察两组海马神经元的损伤情况,Western Blot检测各组大鼠海马KCC2、GABA_ARαl及BDNF蛋白的表达,利用免疫荧光检测海马各区KCC2和GABA_ARαl蛋白时空分布的特点。结果:1.anti-BDNF注射后3h,海马BDNF蛋白含量降至最低。2.动物实验结果:与SE组相比,干预组SE诱发成功率低(分别为90.0%和75.6%),SE诱发成功后生存状态好,死亡率低(分别为16.67%和7.69%)。与SE组相比,干预组诱发SE所需PILO平均用量(分别为24.62±5.49 mg/kg和34.56±9.01mg/kg)、诱发SE所需的平均时间(分别为27.90±13.59min和55.86±17.48min)、Ⅲ级及以上发作平均持续时间(分别为28.13±4.66min和12.77±5.06min)及10%水合氯醛总量平均值(分别为0.38±0.63ml/100g和0.32±0.03 ml/100g)均有明显差异,具有统计学意义(p<0.01)。3.Nissl染色结果:SE组在SE后2h开始出现CA1区锥体神经元丢失和坏死,3d最严重,7d后开始改善;CA3区锥体神经元受损情况与CA1区相似,程度稍轻;门区除了锥体神经元中等程度的丢失和坏死外,还可见锥体神经元突起增多及较多颗粒细胞样的神经元。SE后3d至7d可见齿状回显著神经细胞增生。干预组CA1区在SE后2h可见极少量坏死神经元,6h-24h坏死神经元数量增多,3d时开始恢复,14d时基本恢复正常;CA3区神经元坏死出现较早且较明显,以24h最为明显,7d开始恢复;门区锥体神经元的坏死和丢失以SE后6h最明显,24h可见较多具有多个突起的锥体神经元和少量颗粒细胞样新生细胞,3d后细胞数量及形态开始恢复。齿状回24h后可见神经细胞增生。与SE组相比,干预组在SE后急性期内的病理改变相似,程度明显减轻,恢复快,未遗留明显的海马组织病理学改变,尤以SE后3d开始差异明显,具有统计学意义(p<0.05或p<0.01)。4.KCC2蛋白的表达:SE组KCC2蛋白在SE后2h开始显著下调,6h降至最低,24h开始恢复,14d时仍低于正常。以上各时间点海马KCC2蛋白的表达与正常值相比均有显著差异(p<0.01)。在海马不同亚区,从SE后2h开始,KCC2蛋白表达显著降低首先出现在CA1区,之后是CA3区,齿状回的改变较轻。干预组KCC2蛋白表达在2h显著减少,6h达最低,24h后开始明显恢复,3d时接近正常。干预组2h、6h、24h和3d蛋白含量与对照组相比差异显著,具有统计学意义(p<0.01)。KCC2蛋白在海马各区的时空分布趋势与SE组相似。干预组与SE组相比,SE后2h-3d各时间点KCC2蛋白的表达差异非常显著(p<0.01),7d和14d的差异明显(p<0.05),均具有统计学意义。5.GABA_ARαl蛋白的表达:SE组GABA_ARαl蛋白在SE后2h-6h表达显著下调(p<0.01),24h时GABA_ARαl蛋白含量显著上升,至14d达到最高值(约为正常值的134.85±4.51%,p<0.01)。GABA_ARαl蛋白免疫阳性反应在海马不同亚区表达具有较大的差异。SE后2h开始,CA1区及CA3区的GABA_ARαl蛋白表达显著进行性下调,DG区GABA_ARαl蛋白表达则呈显著上升趋势,直至14d时仍继续增加。干预组GABA_ARαl蛋白表达在SE后2h达最低值,6h后上调,3d达最高值(p<0.01),7d后下调至接近正常值。GABA_ARαl蛋白表达在海马的空间分布特点与SE组相似。与SE组相比,干预组GABA_ARαl蛋白表达变化的幅度小,周期短,两组GABA_ARαl蛋白表达在SE后24h、7d和14d各时间点的差异显著,均具有统计学意义(p<0.01)。6.BDNF蛋白的表达:SE组BDNF蛋白含量在SE后6h开始明显增加,24h达高峰,3d时开始下调,至7d时仍显著高于正常值,约为正常值的123.74±5.43%,与对照组相比,以上各时间点的差异均具有统计学意义(p<0.01),14d时BDNF蛋白表达接近正常。干预组BDNF蛋白含量在SE后2h降低,6h显著增加,24h达最大值,约为正常值121.56±2.63%,与对照组相比,以上各时间点的差异均具有统计学意义(p<0.01),3d时接近正常。与SE组相比,干预组BDNF蛋白的含量及变化幅度均明显低于SE组。从SE后6h至7d,两组相同时间点BDNF蛋白含量差异显著,具有统计学意义(p<0.01)结论:1.KCC2蛋白表达在SE后长期下调可能是SE后GABA_AR介导的兴奋性作用产生的重要机制之一,且可能参与了SE后海马MFS及突触重建的形成,是SRS形成的机制之一。2.SE过程中,BDNF可能通过下调KCC2的表达来影响GABA_AR介导的抑制性作用,这可能在PILO诱导SE模型急性期的病理改变中起着重要的作用。3.Anti-BDNF干预可以通过抑制BDNF的表达,减弱神经活性依赖性的KCC2及GABA_AR抑制作用的下调,延缓癫痫发生并减弱癫痫发作的严重程度和严重发作的持续时间,具有一定神经保护作用。
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