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研究背景卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一[1],其中以上皮性肿瘤发生最常见,约占卵巢恶性肿瘤的70%,女性恶性肿瘤的第六位,癌症相关死亡原因的第五位[2]它具有起病隐匿、易转移、预后差等特点,由于大多数患者早期无明显症状,75%患者确诊已到中晚期,故其死亡率位居女性生殖器恶性肿瘤首位[3]。在过去的很长一段时间里,随着现代检测及治疗手段的改进,卵巢癌治疗取得了长足进展,对于卵巢癌的治疗采取了手术联合化疗及最新的卵巢癌新辅助化疗的技术进步,但卵巢癌的复发转移率和死亡率仍然很高[4-5],由于其较高的转移率及复发率,总体预后依旧较差,五年生存率也仅为30%-40%。因此,积极寻找一种早期准确预测卵巢癌恶性程度及预后的指标,以便更加早期快速的诊断和早期对疾病进行干预是目前研究的热点。既往研究表明:Notch1与肿瘤侵袭转移相关,它参与了肿瘤发生发展[6]。在乳腺癌[7]、结直肠癌等多种组织中,Notch1表达均高于癌旁组织及正常组织。在胃癌组织中,Notch1与远处转移相关,它可以通过环氧化和酶-2促进癌巢形成[8]。在胰腺癌中,Notch1活化核因子λB信号通路,释放VEGF和基质金属蛋白酶促进肿瘤细胞侵袭转移[9]。PDGF-BB具有促进细胞分裂增殖、细胞趋化、血管收缩等生物效应,是决定肿瘤大小、转移、复发和预后的重要因素。PDGF-BB是PDGF家族中的一个重要组成部分,是重要的血管生成因子。它通过与PDGFR结合诱导其酪氨酸激酶磷酸化,促进新生血管的形成,导致肿瘤生长[10]。许多恶性肿瘤如:乳腺癌、前列腺癌等组织中存在PDGF及其受体的高表达,对肿瘤的发展起着推动作用[11]。在肿瘤的发生和发展过程中,多种环境及细胞因素都可对PDGF进行诱导,使其表达增加,缺氧条件下,血管生成刺激因子如VEGF、PDGF会立刻被释放,促进血管生成并对肿瘤组织加速供氧[12]。此外,突变的癌基因和抑癌基因也可诱导PDGF的激活和过表达[13]。目前对于Notch1信号通路在多种肿瘤中研究均较多,而PDGF-BB对于恶性肿瘤的血管生成及侵袭转移方面的影响有直接关系,二者是否对于肿瘤的发生发展过程有着递进的关系且二者是否存在相关性有待进一步实验证明。本研究针对以上问题逐步展开,报道Notch1和PDGF-BB在卵巢癌组织中的表达情况,通过研究Notch1和PDGF-BB在临床病理资料的相关性,报道了Notch1和PDGF-BB与临床病理的密切关系及二者在卵巢癌组织中的表达的线性关系。我们在卵巢癌细胞系中进一步证实了Notch1和PDGF-BB的生物学功能,初步评估了Notch1与PDGF-BB在卵巢癌侵袭转移中的关联性,对于未来临床中卵巢癌的早期诊断提供了新的思路。目的1.Notch1和PDGF-BB在卵巢癌组织中的表达及相关性分析;2.下调Notch1在卵巢癌细胞中的表达及其侵袭转移的影响;3.下调Notch1在卵巢癌中的表达对其生存能力及凋亡的影响;4.下调Notch1,验证PDGF-BB在卵巢癌细胞中的表达;5.下调PDGF-BB在卵巢癌细胞中的表达及其侵袭转移的影响。方法1.Notch1和PDGF-BB在卵巢癌组织中的表达与其临床病理的相关性分析。a)运用免疫组织化学技术分析Notch1和PDGF-BB在60例上皮性卵巢癌和10例正常卵巢石蜡标本组织中的表达;b)应用spss17.0统计软件进行分析,进行卡方检验及求Spearman相关系数。2.应用RT-PCR和Western-blot分别分析四种卵巢癌细胞中Notch1的基因表达和蛋白表达情况,Transwell法检测四种卵巢癌细胞的侵袭迁移能力。Notch1 si RNA分别转染高转移卵巢癌细胞株HO-8910PM和低转移株卵巢癌细胞株HO-8910,观察转染后卵巢癌细胞株的Notch1的基因和蛋白表达情况,Transwell法检测转染后卵巢癌细胞的生物学功能并对穿膜细胞进行计数分析。3.Notch1 si RNA分别转染高转移卵巢癌细胞株HO-8910PM和低转移株卵巢癌细胞株HO-8910,用MTT法及酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值反应细胞生存能力,用AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡情况。4.Notch1 si RNA分别转染高转移卵巢癌细胞株HO-8910PM和低转移株卵巢癌细胞株HO-8910,观察转染后卵巢癌细胞株的PDGF-BB基因表达情况,Notch1和PDGF-BB蛋白表达情况,ELISA法检测PDGF-BB在细胞上清中的浓度。5.PDGF-BB siRNA分别转染高转移卵巢癌细胞株HO-8910PM和低转移株卵巢癌细胞株HO-8910,观察转染后卵巢癌细胞株的PDGF-BB蛋白表达情况。Transwell法检测转染后卵巢癌细胞的生物学功能并对细胞进行计数分析。结果1.观察Notch1和PDGF-BB在卵巢癌组织中的表达情况及临床病理的相关性分析。a)卵巢癌组织中可见Notch1和PDGF-BB表达;b)Notch1阳性染色主要位于细胞膜中,细胞核、细胞浆也有部分表达。在卵巢癌组织中,63%(38/60)高表达,37%(22/60)低表达;在10例正常卵巢组织中,部分染色显示高表达20%(2/10),其余均为低表达;c)PDGF-BB阳性染色主要位于细胞浆中。在卵巢癌组织中,60%(36/60)高表达;40%(24/60)低表达。在正常卵巢组织中,部分染色显示高表达10%(1/10),其余均为低表达;d)PDGF-BB与Notch1表达水平与卵巢癌的FIGO分期、病理分级、淋巴结转移相关(P<0.05),Notch1与卵巢癌患者年龄、组织类型无关(P>0.05),PDGF-BB与患者年龄无关(P>0.05),与组织类型相关(P<0.05);e)Spearman相关性分析显示:PDGF-BB表达与Notch1的表达呈正相关(r=0.696,P<0.01)。2.下调Notch1在卵巢癌细胞中的表达,观察卵巢癌细胞的生物学效应分析。a)RT-PCR和Western-blot分别对HO-8910PM,SKVO3,3AO和HO-8910四种卵巢癌细胞中Notch1的基因表达和蛋白表达情况进行检测,HO-8910PM卵巢癌细胞基因表达及蛋白表达均最高,HO-8910卵巢癌细胞二者均低;b)HO-8910PM,SKVO3,3AO和HO-8910卵巢癌细胞侵袭和迁移穿膜细胞统计显示:侵袭组和迁移组HO-8910PM细胞数较多,说明其侵袭迁移能力较强,侵袭组和迁移组HO-8910细胞数较少,说明其侵袭迁移能力较弱;c)对高转移卵巢癌细胞株HO-8910PM和低转移株卵巢癌细胞株HO-8910转染Notch1 si RNA后,RT-PCR检测Notch1转染组基因表达水平均低于对照组和未转染组,Western-blot分析Notch1转染组蛋白表达均低于对照组和未转染组,Transwell法检测HO-8910PM和HO-8910卵巢癌细胞侵袭和迁移能力,对其细胞计数表明Notch1转染组穿膜细胞计数均低于对照组和未转染组(P<0.05)。3.下调Notch1在卵巢癌细胞中的表达,对其细胞生存能力及细胞凋亡的影响评估。a)用MTT法检测经转染Notch1si RNA的卵巢癌细胞490nm波长处测定其光吸收值显示,转染组与对照组和未转染组比较,无明显差异(P>0.05);b)用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡结果:转染组与对照组、未转染组比较,无明显差异(P>0.05)。4.对高转移卵巢癌细胞株HO-8910PM和低转移株卵巢癌细胞株HO-8910转染Notch1si RNA后,RT-PCR分析PDGF-BB在细胞中的基因表达水平均低于对照组和未转染组。Western-blot分析卵巢癌细胞中Notch1和PDGF-BB的蛋白表达均低于对照组和未转染组,ELISA分析卵巢癌细胞中PDGF-BB细胞上清浓度均低于对照组和未转染组,有统计学差异(P<0.05)。5.对高转移卵巢癌细胞株HO-8910PM和低转移卵巢癌细胞株HO-8910转染PDGF-BB si RNA后,Western-blot分析PDGF-BB转染组蛋白表达均低于对照组和未转染组。Transwell法检测HO-8910PM和HO-8910卵巢癌细胞侵袭和迁移能力,对其穿膜细胞计数表明PDGF-BB转染组均低于对照组和未转染组(P<0.05)。结论1.本实验确定了Notch1和PDGF-BB在卵巢癌组织和细胞中表达情况。证明了Notch1和PDGF-BB在卵巢癌组织中均为高表达且而二者具有线性相关性,证明二者在卵巢癌发生发展中有着共同的信号通路。2.发现PDGF-BB与Notch1表达水平与卵巢癌的FIGO分期、病理分级、淋巴结转移相关,PDGF-BB还与卵巢癌病理分型相关,二者均与年龄无关,证明了二者在卵巢癌恶性潜能中起着重要作用。3.下调Notch1可减弱卵巢癌细胞的侵袭迁移能力,并能同时减弱PDGF-BB的表达,但并不能对卵巢癌细胞的生存能力及凋亡产生明显影响,证实了Notch1正性调控PDGF-BB,可能存在PDGF-BB阳性的卵巢癌细胞在Notch1通路作用下,过度促进新生血管形成,从而诱发肿瘤的发生发展过程。