生物柴油是生物质能的一种形式,具有绿色、可再生、能耗低等优点,能够缓解石油即将枯竭和环境污染对人类造成的危机,成为国内外重点研究开发的热点。和传统的化学催化法相比,脂肪酶法合成生物柴油反应条件温和、能耗低、绿色环保。但固定化脂肪酶的规模制备存在技术困难,需要复杂的纯化和固定化步骤,常会导致酶活降低、成本上升,这也是工业上酶法生产生物柴油的主要障碍。目前,采用全细胞催化等技术工艺有望解决这些难题。本研究以表面展示有米黑根毛霉脂肪酶的毕赤酵母细胞作为催化剂,它具有固定化酶的特点,且酶制剂生产工艺简单,将发酵液直接离心收集菌体,真空冷冻干燥制得菌体冻干粉,无需固定化即可用于催化生物柴油的生产。本研究首先对酵母表面展示脂肪酶的全细胞催化剂的冻干工艺进行了研究,通过比较不同离子和冻干保护剂在冻干过程中对酶的影响,发现菌体重悬液经过Ca2+预处理以及添加海藻糖后,能有效提高全细胞催化剂的合成活力和转酯活力,初步解决了酵母表面展示脂肪酶在冻干过程中的酶活损失问题。对该酶催化大豆油脂合成脂肪酸甲酯的批次反应条件进行了系统地研究,结果表明:异辛烷为最适宜的反应介质,且异辛烷与大豆油的体积比为2,最适温度为55℃,全细胞添加量为40% (w/w,基于油重),最适醇油摩尔比为4.5:1,最适初始水活度为0.66,在反应时间为0 h,24 h和48 h时分别加入醇油摩尔比为1.5,1.5和1.5的甲醇,反应72 h后,脂肪酸甲酯产率达到83.14%。该脂肪酶可重复利用,在55℃下反应10批次后脂肪酸甲酯产率仍能达到第一批次的80.46%,表明该全细胞催化剂具有较好的操作稳定性。在单因素优化的基础上,确定反应温度、催化剂用量及醇油摩尔比等为显著影响因素。采用三因素五水平的中心组合设计,研究这3个因素及其交互作用对甲酯产率的影响。利用Minitab15软件对转酯反应过程进行响应面优化,优化后的条件为:全细胞添加量48%(w/w,基于油重)、醇油摩尔比5.8:1、反应温度52℃。在最优条件下,反应72 h后的甲酯产率为89.17%,非常接近理论预测值88%,高于单因素优化条件下的甲酯产率(83.14%)。在响应面优化的基础上,对500 ml搅拌反应体系中甲酯的合成工艺参数进行了优化,最优条件为:反应体积为200 ml,全细胞添加量为60%(w/w,基于油重),分3次(0,12 h和36 h)等量添加酶粉,转速300 rpm,添加12 g 3A分子筛。在此条件下,ME产率可达86.88%,接近摇床反应水平,表明扩大反应体系,展示RML的毕赤酵母全细胞仍能高效催化大豆油转酯生产生物柴油。本研究还以煎炸油为原料,对展示RML的毕赤酵母全细胞催化该原料制备生物柴油的主要工艺参数进行了优化,最优的转酯反应条件为:石油醚为最佳反应介质,石油醚与煎炸油的体积比为2.5:1,全细胞添加量为60%(与煎炸油的质量比),醇油摩尔比为4.5:1,在0、12 h和24 h分别加入醇油摩尔比为1.5的甲醇,在此优化条件下,反应72 h后,脂肪酸甲酯产率可达到80.06%。初步摸索了生物柴油粗产品的精制、分离方法,利用旋转蒸发可分离得到较纯的生物柴油产品。对得到的生物柴油产品,通过外观、主要成份的气相色谱分析以及性能指标的检测,表明分离后的产品纯度较高。