粘细菌是一类革兰氏阴性杆状细菌，在分类上属于变形菌门的6分支。粘细菌具有复杂的多细胞协同的社会性行为，在原核生物细胞信号调控和进化的研究中是重要的模式材料；同时粘细菌可以产生种类多、结构新、作用机理新颖多样的次级代谢产物，是一类重要的药源微生物。但是由于其不充分的分子生物学操作技术，粘细菌的遗传学研究受到了很大限制。 在过去近五十年的时间中，科研工作者一直没有发现能够在粘细菌中自主复制的质粒，而且其他菌目来源的广宿主范围质粒均不能在粘细菌中自主复制，必须整合到细胞染色体上才能在胞内存在。所以粘细菌的遗传学研究受到了极大限制。本实验室与中国科学院植物生理生态研究所合作，从Myxococcus fulvus124802中分离到环形质粒pMF1。质粒的最小复制区已经得以鉴定，基于该内源性质粒的复制区域和E．coli克隆载体pSP72构建了Myxococcus-E．coli穿梭载体pZJY41和pZJY156，这在很大程度上方便了粘细菌中的遗传操作（Zhao et al2008）。但是，该穿梭载体在中显示了极大的遗传不稳定性，在无选择压力下质粒很快的丢失。pZJY41和pZJY156的遗传不稳定性极大的限制了穿梭载体的应用。 许多因素都会影响原核质粒遗传稳定性，主要包括质粒的拷贝数，质粒后自杀系统，质粒位点特异性重组系统，以及质粒自主分配系统。目前认为对于低拷贝质粒保持遗传稳定性最为重要的系统是质粒的自主分配系统。质粒的自主分配系统使质粒拷贝在细胞分裂中有效的分配到子代细胞中。低拷贝质粒除了含有质粒自主分配系统，有时还编码所谓的后自杀系统（PSK），通过杀死不含有质粒的子代细胞来保证质粒的遗传稳定性。质粒后自杀系统可以认为是当par系统不能很好起作用的时候保证质粒稳定性的最后的办法。 所有研究过的质粒编码的自主分配系统即par系统都编码三个组分，包括同一个operon控制下的两个反式作用蛋白和一个或两个顺式作用位点。顺式作用位点又称为类着丝粒位点。这两个蛋白和顺式作用位点对于质粒自主分配系统来说缺一不可。总体上讲，质粒自主分配有关的par系统是独立于复制子外，作为一个功能区发挥其作用的。质粒分配系统操纵子的第一个基因编码一个ATPase。第二个基因编码一个DNA结合蛋白。这个DNA结合蛋白识别自主分配系统中类着丝粒位点的各个正向或反向重复序列。DNA结合蛋白结合到这些位点上形成核酸蛋白复合物，即分配复合物。这种分配复合物作为分配系统发挥作用的底物，被定位于细胞中的中心位置或是沿纵轴的其他位置，以便在细胞分裂时平均分配到子细胞中。 本论文根据其他低拷贝质粒遗传稳定研究背景和pMFl的全序列信息，在实验室已完成工作的基础上，进一步分析了pMF1可能的自主分配区域的DNA序列特点。预测的质粒自主分配区域包括3个可能的完整ORFs编码基因pMF1．21，pMF1．22和pMF1．23；同时包括上下游的几种拷贝数低的不完美的短正向重复序列，以及几个拷贝的长正向重复序列。据此，以pMF1为模板扩增更长的DNA序列，包括pMF1的17242-50，17242-1136和16604-1136三种不同的片段，它们分别包含了pMF1上预测的跟质粒分配有关的三个可能的ORFs编码基因及其上下游不同长度的非编码区．将上述片段克隆到pZJY41中，得到pZJY4112，pZJY4111和pZJY4114，测试其在Myxococcus xanthus DZ1中的遗传稳定性。实验结果表明，pZJY4112在DZ1中的稳定性比pZJY41有一定的提高。这表明，预测的质粒自主分配区域在质粒的遗传稳定性控制中确实起到了重要的作用。同时我们得到了遗传稳定性提高的穿梭载体，对粘细菌具有重要的应用价值。 在本论文中，我们同时运用其他思路开展了质粒稳定区域相关研究，即不考虑预测到的序列信息，用分段筛选pMF1序列的方法，寻找质粒的遗传稳定区域。在实验室前期工作中构建了pMF1 的两个亚克隆pSQ37和pSQ38，它们共同包含了pMF1的全部片段，只不过在pMF1上两个EcoRI位点分离开来。因此，首先进行了pMF1亚克隆上两个片段遗传稳定功能研究。将两个亚克隆上的pMF1片段分别克隆到pZJY41上，得到pZJY4116和pZJY4117两个重组载体。测定这两个载体在DZ1中的稳定性发现，pZJY4117的DZ1转化子质粒被剪切，这可能是因为pZJY41中的插入片段过长，导致质粒二级结构不稳定被剪切。pZJY4116的遗传稳定性仍然很差，但没有被剪切，可能是质粒的插入片段里含有遗传稳定相关区域，但插入片段很长导致质粒很大，使其遗传稳定性差。然后，我们对两个亚克隆上的pMF1片段分别用两种限制性内切酶单独酶切pMF1片段，分段研究pMF1片段的遗传稳定功能。pMF1酶切片段与pZJY41/EcoRV连接后得到pZJY4101-pZJY4108几个重组载体。 实验结果表明，虽然含有pMF1亚克隆上的片段的重组载体的遗传稳定性没有提高，但是含有酶切的pMFl片段的重组载体的稳定性有一定的差异。pZJY4102的遗传稳定性较pZJY41有一定的提高，接近pZJY4112的稳定性；pZJY4103的遗传稳定性较pZJY41有较大程度的提高。pZJY4102和pZJY4103的遗传稳定性比之前基于pMF1的复制区构建的穿梭载体遗传稳定性都要高，其稳定性提高的原因很可能是由于含有pMF1的质粒自主分配区域。同时，pZJY4103比pZJY4102的遗传稳定性更高，可能是pZJY4103相对于pZJY41的插入片段比pZJY4102的插入片段长出的一部分起了一定的作用。这部分长出的片段（pMF1的16382-17270）可能编码了与遗传稳定性有关的，不同于质粒自主分配系统的基因；也可能编码了pMF1自主分配系统的一部分，但是这部分不包括在pZJY4102中，因此后者的遗传稳定性要比pZJY4103低一些。 为了进一步提高穿梭载体的遗传稳定性，将预测的重组酶基因pMF1．16克隆到pZJY4103上，得到pZJY4109；同时，根据pZJY4101和pZJY4104在DZ1中遗传稳定性的差异，以及pZJY4104虽然在传代20代后质粒很快的丢失，但是在前10代的稳定性很高，推测pMF1的971-3680可能对质粒的稳定性起到一定的作用，因此将pMF1的971-3680克隆到pZJY41上，得到pZJY4110。测定这两个重组载体的稳定性发现，pZJY4109的稳定性比pZJY4103的稳定性没有明显提高，说明预测的重组酶基因pMF1．16质粒的遗传稳定性没有明显的作用；但是也不能说明位点特异性重组系统对质粒的遗传稳定性不起作用。pZJY4110的遗传稳定性比起pZJY4103并没有提高。 在本论文中，获得了比pZJY41稳定性提高的穿梭载体pZJY4102、pZJY4103，pZJY4109，pZJY4111和pZJY4112。这几个载体极大的方便了粘球菌中的遗传操作，具有重要的应用价值。这些载体都包含预测的质粒自主分配区域，说明质粒自主分配区域对质粒在DZ1中的遗传稳定性确实起到非常重要的作用；pZJY4103的遗传稳定性大于pZJY4102，说明除了质粒自主分配区域以外，pMF1上可能还存在其他的区域，通过其他的机制控制质粒的遗传稳定性，这还需要进一步的研究来证明。另外，预测的质粒自主分配区域含有三个完整的编码ORFs以及其上下游的拷贝数较低且不完美的重复序列，而在质粒自主分配区域含有三个完整ORFs的现象是从未报道过的，暗示了粘细菌内源性质粒可能通过特殊的质粒自主分配系统完成质粒的分配。这些对于粘细菌的研究都具有重要的理论意义。