背景与目的随着人们生活水平提高及人口老龄化,动脉粥样硬化性心血管病（arteriosclerotic cardiovascular disease,ASCVD）发病率逐年增加。然而,ASCVD的确切病因尚不明确,可能是多种危险因素作用于不同环节所致,包括年龄、性别、血脂异常、高血压、糖尿病、肥胖、吸烟及家族史等。2013年AHA/ACC《成人超重和肥胖管理指南》指出,肥胖是脂质代谢紊乱的核心,是ASCVD的重要危险因素。肥胖的发生涉及食物摄入过多和/或能量消耗减少的病理过程,而神经肽Y（neuropeptide Y,NPY）作为机体能量代谢过程中的调节因子,参与了肥胖的发生与发展。NPY是一个由36个氨基酸组成的多肽,广泛分布于中枢神经系统、周围神经系统及周围组织中。NPY虽在全脑都有表达,但以下丘脑弓状核表达水平最高。NPY参与调节多项生理过程,促进摄食,提高能量摄入,减少能量消耗。NPY/刺鼠基因相关蛋白（agouti gene-related protein,AgRP）和阿片-促黑素细胞皮质素原（proopio-melanocortin,POMC）神经元在弓状核区域分布最多,不仅发挥着刺激食欲的作用,还可通过NPY-Y1受体或神经递质γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid,GABA）抑制POMC神经元的厌食效应。因此下丘脑弓状核的相关神经元和肥胖有着密切的联系。新近研究发现冷刺激可激活小鼠和人类棕色脂肪组织（Brown adipose tissue,BAT）及米色脂肪组织（Beige adipose tissue,BeAT）,从而提出冷刺激可预防和控制肥胖的观点。冷刺激是一种“应激”状态,通过激活交感神经系统,参与了许多与饮食相关的机制,也是促进体重减轻的主要机制,包括了β-肾上腺素受体介导的脂解,白色脂肪组织（WAT）中脂肪细胞增殖抑制,及刺激BAT产热。然而,令人费解的是肥胖人群交感神经活动似乎较消瘦人群有所增加,表明β-肾上腺素能的活动可能在某些方面也会促进体重增加。为阐明慢性冷刺激对能量平衡和葡萄糖稳态的影响,并阐明导致这些影响的潜在中枢机制,本研究首先通过构建冷刺激小鼠模型方式,探讨高脂饮食背景下,冷刺激是否能够起到减肥的作用,以及在此过程中中枢神经系统NPY的调控机制。肥胖的干预措施有多种,包括调整饮食结构、加强锻炼及减少食欲等。新近研究证明大脑中枢神经系统中核因子κB受体活化因子配体（Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand,RANKL）/核因子κB受体活化因子（Receptor Activator for Nuclear Factor-κB,RANK）与能量稳态之间存在某种联系。RANKL是一种由317个氨基酸组成的多肽,属于肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）家族。RANKL/RANK的蛋白和mRNA在骨、骨髓、淋巴组织、大脑的下丘脑和中隔区域中表达。已有研究发现在神经性厌食症患者血液中观察到RANKL水平升高,且RANKL水平升高程度与神经性厌食症严重程度一致。由此我们推测RANKL/RANK可以起到减少食欲的作用。有学者在对骨重建的相关研究中发现,RANKL/RANK信号通过可卡因-苯丙胺调节转录肽蛋白（cocaine-amphetamine-regulated transcript,CART）和NPY调节。故而我们提出了“下丘脑区域存在的RANKL/RANK是否可以通过作用于分布在同一区域的NPY神经元,从而影响食欲”的科学假设,为验证上述假设的合理性,我们对“RANKL/RANK是否通过下调下丘脑NPY神经元来减少食物摄入并导致体重减轻,及其可能的具体机制”进行了探索。肥胖与血糖异常、血脂异常往往并存,属于代谢综合征（metabolic syndrome）的范畴,它们之间有许多相互联系的机制。在临床工作中,我们也常见到罹患心血管疾病的肥胖患者经常合并低密度脂蛋白（Low-Density Lipoprotein,LDL）升高、高密度脂蛋白降低、高甘油三酯等血脂异常。有研究证实高血脂会导致大脑中枢神经系统NPY分泌增加。众多研究已证实,LDL在血脂异常及心血管疾病发生发展中处于核心地位,也是ASCVD治疗中关注的焦点。另有研究显示LDL受体（Low-Density Lipoprotein Receptor,LDLR）的缺乏会减少脂肪合成,增加热量生成,从而导致体重减轻。我们推测血脂相关成分有可能激活下丘脑NPY神经元,而激活下丘脑NPY神经元的血脂成分可能是LDL/LDLR。针对上述推测,我们对“LDL/LDLR是否可以通过中枢神经系统NPY通路参与机体脂肪与能量代谢的调控”进行了初步研究。研究方法1.冷刺激对高脂饮食小鼠代谢的影响及中枢NPY参与调控的机制1.1实验动物的选取与分组野生型C57BL小鼠56只,NPY-GFP标记（NPY启动子控制下表达绿色荧光蛋白GFP）的C57BL小鼠28只,分为三组进行研究。其中,28只野生型C57BL小鼠用于研究能量的摄入,包括体重测定、脂肪组织的质量,葡萄糖以及胰岛素耐受性以及下丘脑目标蛋白的原位杂交,28只野生型C57BL小鼠用于研究下丘脑杏仁核区域c-fos表达,28只NPY-GFP小鼠用于确定NPY-GFP小鼠中的NPY神经元是否被冷刺激和HFD激活。1.2实验动物饲养方法小鼠10周龄后,每组小鼠均采用两种饲养喂养,即一半喂食标准食物,另一半喂食高脂饮食（HFD）。1.3实验动物的冷刺激干预方法小鼠10周龄后,每组小鼠各14只（标准食物7只,高脂饮食7只）同时进行冷刺激干预。方法:将小鼠放置在冰水混合物中（0℃）,其深度为0.5cm,每天1小时,持续7周。非冷刺激的小鼠同时放置在室温水中（23℃）。1.4实验动物的体重测量和食物摄入量评估用于能量摄入研究的28只野生型C57BL小鼠,每周一次同一时间进行称重。当小鼠为10,12,14和17周龄时,测量24小时内食物摄入量,并以能量摄入量（kJ/天）计算。1.5实验动物的糖代谢检测16周龄,即开始HFD和冷刺激干预6周后,对能量摄入研究的28只野生型C57BL小鼠进行葡萄糖和胰岛素耐量试验。其中,胰岛素耐量试验安排在葡萄糖试验后的两天进行。1.6实验动物的标本留取17周龄时,即开始HFD和冷刺激干预7周后,100mg/kg氯胺酮和20mg/kg甲苯噻嗪麻醉后,处死所用三组实验动物。用于能量摄入研究的28只野生型C57BL小鼠解剖分离了其肩胛间的棕色脂肪组织（BAT）以及腹股沟,附睾,肠系膜和腹膜后的白色脂肪组织（WAT）并称重。三组实验动物的大脑组织收集办法均为生理盐水灌注后,经4%多聚甲醛固定,然后30%蔗糖溶液脱水,最后-70℃保存。1.7 c-fos组小鼠免疫组化检测用于c-fos表达研究的28只野生型C57BL小鼠经7周HFD和冷刺激干预后,收集的大脑组织采用免疫组织化学检测杏仁核区域的c-fos免疫反应性,并经Zeiss Axioplan光学显微镜（Carl Zeiss Imaging Solutions GmbH,Munich,Germany）计数定量。1.8 NPY-GFP组小鼠c-fos与NPY双染定位检测28只转基因NPY-GFP小鼠经7周HFD和冷刺激干预后,收集的大脑组织采用免疫组织化学的方法,同时检测红色的c-fos活性神经元和绿色的GFP阳性NPY神经元,并经Zeiss Axioplan光学显微镜（Carl Zeiss Imaging Solutions GmbH,Munich,Germany）计数定量。1.9脑组织原位杂交检测采用能量摄入研究的28只野生型C57BL小鼠大脑组织进行原位杂交实验,分别检测下丘脑腹内侧核（VMH）和室旁核（PVH）中脑源性神经营养因子（BDNF）和生长素释放激素（GHRH）的信使核糖核酸（mRNA）表达。1.10数据统计使用GraphPad Prism Version 6.0（GraphPad Software,Inc）进行所有统计学分析。2.RANKL对小鼠食物摄入和体重的影响及中枢NPY参与调控的机制2.1实验动物的选取与分组野生型C57BL6雄性小鼠30只,转基因NPY-GFP小鼠8只,分为4组用于该研究。其中,12只野生型C57BL6雄性小鼠植入了大脑微量泵,用于观察RANKL注射与体重和食物摄入间的关系;10只野生型C57BL6雄性小鼠用于检测RANKL注射30分钟后,下丘脑区域c-fos表达情况;8只转基因NPY-GFP小鼠用于检测RANKL注射30分钟后,下丘脑区域c-fos和NPY共同表达情况;8只野生型C57BL6雄性小鼠用于检测RANKL注射30分钟后,下丘脑区域c-fos和CART mRNA共同表达情况。2.2实验动物的干预方式小鼠给予RANKL的途径分为两种,观察RANKL注射与体重和食物摄入组小鼠,采用小鼠脑室内植入微渗透注射泵的方式,以方便一周内持续稳定地给药;其余3组小鼠,均采用鼠尾静脉一次性给药的方式。各组小鼠均分为干预组和对照组,干预组每天10μg RANKL/1ml生理盐水注射,对照组为1ml生理盐水。2.3实验动物的体重测量和食物摄入量评估体重和食物摄入组小鼠采用普通饮食喂养,予以每天大脑微渗透注射10μg RANKL/1ml生理盐水或1ml生理盐水,同时进行体重测量,其中,1ml生理盐水注射组死亡1只小鼠。第8天,分别测量干预组和对照组24小时（从第7天10:00到第8天10:00）的累积食物摄入量。2.4实验动物大脑组织干预30分钟后原位杂交测定观察RANKL注射后即刻效应的3组小鼠,均采用小鼠尾静脉一次性注射10μg RANKL/1ml生理盐水或1ml生理盐水。注射完30分钟后,100mg/kg氯胺酮和20mg/kg甲苯噻嗪麻醉处死该组小鼠,经生理盐水灌注、4%多聚甲醛灌注固定后,取出大脑组织经30%蔗糖溶液脱水过夜。大脑组织切成厚度为30μm的冠状切片,经原位杂交法分别测定下丘脑区域的c-fos、c-fos与NPY双标、c-fos与CART mRNA共染表达情况。2.5实验动物大脑组织干预1周后原位杂交测定体重和食物摄入组小鼠在第8天,采用2.4所述方法制备大脑组织标本,经原位杂交法测定Arc中的NPY、CART、POMC、AgRP的mRNA水平,以及DMH中的CART的mRNA水平。2.6数据统计方法同1.10.3.LDL对小鼠体重的影响及中枢NPY参与调控的机制3.1实验动物的选取与分组野生型C57BL6雄性小鼠12只,LDLR^-/-小鼠18只,转基因NPY-GFP小鼠6只,分为3组用于该研究。其中,LDLR^-/-小鼠12只用于检测小鼠体重的变化;野生型C57BL6雄性小鼠12只、LDLR^-/-小鼠6只,用于测定即刻c-fos表达情况;转基因NPY-GFP小鼠6只,用于检测c-fos和NPY共表达情况。3.2实验动物的喂养方式与体重测量LDLR^-/-小鼠12只,分为高脂饮食和正常饮食两组,每周相同时间测量小鼠体重,共观察10周。3.3实验动物大脑组织c-fos测定野生型C57BL6雄性小鼠12只、LDLR^-/-小鼠6只,分为对照组（C57BL小鼠注射尾静脉注射生理盐水）、注射组（C57BL小鼠注射尾静脉注射LDL）、敲除注射组(LDLR^-/-小鼠注射尾静脉注射LDL),分别经鼠尾静脉注射30分钟后,100mg/kg氯胺酮和20mg/kg甲苯噻嗪麻醉处死该组小鼠,经生理盐水灌注、4%多聚甲醛灌注固定后,取出大脑组织经30%蔗糖溶液脱水过夜。大脑组织切成厚度为30μm的冠状切片,经原位杂交法分别测定下丘脑区域的c-fos表达情况。3.4实验动物大脑组织c-fos和NPY共表达情况测定转基因NPY-GFP小鼠6只,经鼠尾静脉注射LDL 30分钟后,采用3.3所述方法,利用免疫组织化学技术检测下丘脑弓状核中c-fos和NPY共表达情况。3.5数据统计方法同1.10.结果1冷刺激对高脂饮食小鼠代谢的影响及中枢NPY参与调控的机制1.1冷刺激和HFD对体重和食物摄入的协同作用四组比较,冷刺激加高脂饮食组小鼠体重增加最多,其次为高脂饮食组小鼠,第三为冷刺激组小鼠,最后为标准饮食组小鼠。干预2、4、7周时,分别测定食物摄入量,其曲线趋势与体重增加一致。1.2冷刺激使HFD喂养的小鼠的葡萄糖代谢恶化葡萄糖耐量实验中,无论是标准饮食喂养还是HFD喂养的小鼠,冷刺激都使小鼠的葡萄糖清除能力降低,表现出更差的糖耐量。但是,改为注射胰岛素后,冷刺激不能改变不同饮食组小鼠的血糖水平。1.3冷刺激和HFD导致小鼠体内WAT重量增加小鼠WAT总质量,冷刺激加HFD喂养组最大,HFD喂养组次之。小鼠BAT质量在四组小鼠之间没有差异。1.4冷刺激激活小鼠中枢杏仁核神经元无论是标准饮食喂养还是HFD喂养的小鼠,冷刺激均使小鼠下丘脑中央杏仁核区c-fos阳性神经元显著增加。同时,高脂饮食组的小鼠也较标准饮食组小鼠表现出更多的c-fos阳性神经元。1.5冷刺激激活小鼠中枢杏仁核NPY神经元高脂饮食喂养下,冷刺激使NPY-GFP小鼠下丘脑中央杏仁核区域具有更多的活化NPY神经元,并且,小鼠下丘脑中央杏仁核切片显示:活化的神经元中,61%呈现c-fos和NPY双染阳性。1.6冷刺激抑制BDNF mRNA的表达,诱导GHRH mRNA的表达无论是标准饮食喂养还是HFD喂养的小鼠,冷刺激均使小鼠VMH的BDNF mRNA的表达下降,PVN的GHRH mRNA表达上升,而HFD喂养相对于标准饮食,也有类似的作用。2 RANKL对小鼠食物摄入和体重的影响及中枢NPY参与调控的机制2.1 RANKL给药后的体重变化和食物摄入量改变给与中枢RANKL的小鼠与对照相比,RANKL组小鼠体重显著减少,且具有较低的食物摄入量。2.2 RANKL给药后下丘脑神经元c-fos免疫活性测定在下丘脑弓状核（Arcuate nucleus,Arc）和背内侧核（DMH）区域中,RANKL处理组的c-fos阳性神经元明显多于对照组。2.3 RANKL给药后下丘脑神经元NPY和CART mRNA与c-fos神经元共定位检测在Arc中,RANKL组NPY-GFP神经元和c-fos的表达区域有54%重叠。结合c-fos免疫组织化学和原位杂交的双标记方法显示,RANKL组在DMH约72%的神经元c-fos和CART mRNA共表达。2.4 RANKL给药后下丘脑神经元NPY、CART、POMC、AgRP mRNA表达在Arc中,RANKL处理组与对照组相比,NPY mRNA表达显著降低,CART mRNA表达显著增加。在DMH中,RANKL组中CART mRNA表达上调。3 LDL对小鼠体重的影响及中枢NPY参与调控的机制3.1 LDL高脂饮食不额外增加LDLR^-/-小鼠体重高脂饮食组较普通饮食组,LDLR^-/-小鼠体重无显著差异。3.2 LDL通过下丘脑弓状核LDLR激活下游神经元鼠尾静脉注射LDL后,C57BL6小鼠下丘脑弓状核c-fos表达增加,而LDLR^-/-小鼠较对照组无明显差异,并显著低于LDL刺激C57BL6小鼠组。3.3 LDL升高下丘脑弓状核NPY表达鼠尾静脉注射LDL后,NPY-GFP小鼠模型弓状核NPY神经元表达显著增加,并且81%的c-fos神经元与NPY神经元在同一区域。结论1冷刺激通过激活小鼠中枢杏仁核NPY神经元,抑制VMH的BDNF mRNA表达,诱导PVN的GHRH mRNA表达,从而导致小鼠食物摄入量增加、体重增加、WAT质量增加,以及葡萄糖耐量下降。在这一过程中,HFD起到了协同作用。2 RANKL通过小鼠下丘脑Arc的NPY mRNA表达降低、以及Arc和DMH的CART mRNA表达上调,造成小鼠食欲下降,从而减轻高脂饮食对体重的影响。3 LDL通过小鼠下丘脑Arc的NPY神经元LDLR激活NPY神经元,导致周围脂质代谢与能量代谢紊乱,从而导致肥胖。