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[背景与目的] 2014年公布的全球癌症统计结果显示目前结直肠癌(colorectal cancer,CRC)发病率男性和女性分别位居第3和第2位,死亡人数约占全部恶性肿瘤死亡总人数的8％,居恶性肿瘤的第4位。而在我国CRC排名略低于西方发达国家,其发病率男性和女性分别位居第5和第6位。结直肠锯齿状病变(colorectal serrated lesion)作为CRC的癌前病变,包括各种亚型,其中增生性息肉(hyperplastic polyp,HP)最常见,比例在75%以上,根据组织学上粘液的不同其又细分为微泡型增生性息肉(microvesicular hyperplastic polyp,MVHP)、富于杯状细胞型增生性息肉(goblet-cell rich hyperplastic polyp,GCHP)、黏液缺乏型增生性息肉(mucin-poor type,MPHP)三种。广基(无蒂)锯齿状腺瘤/息肉(sessile serrated adenoma/polyp,SSA/P)比例在15%~25%,根据细胞异型性又细分为伴/不伴有细胞异型增生。传统型锯齿状腺瘤(traditional serrated adenoma,TSA)其比例在1%左右,具有细胞异型性明显特点。结直肠锯齿状病变的发生依赖于结直肠结直肠锯齿状通路中有众多基因发生异常改变。这些异常改变中以甲基化最常见。 本研究通过MethyLight方法一方面分析结直肠锯齿状病变中CDX2和MGMT基因启动子区CpG岛甲基化及免疫组化中CDX2和MGMT蛋白的表达情况,在基因层面和蛋白层面对CDX2和MGMT进行初步探究;另一方面分析结直肠锯齿状病变中CDX2和MGMT基因启动子区CpG岛甲基化和年龄相关因素情况,在甲基化和年龄上对CDX2和MGMT进行初步探究。 [方法] 收集北京军区总医院2007-2013年病理诊断为各类结直肠息肉和腺瘤切片4810例,从中筛选出腺体具有锯齿状特征的息肉及腺瘤,进行组织学诊断及分类。由3名病理医师按WHO(2010)消化系统肿瘤分类及文献标准4-5轮回顾性阅片。从中筛选出225例结直肠锯齿状病变(96例HP、61例SSA/P和68例TSA)作为实验组,同时收集54例管状腺瘤(tubular adenoma,TA)、42例正常组织和69例CRC作为对照组,MethyLight方法分析结直肠锯齿状病变中CDX2和MGMT基因启动子区CpG岛甲基化及免疫组化方法分析CDX2和MGMT蛋白的表达情况,并收集相关临床及内窥镜资料,分析结直肠锯齿状病变中CDX2和MGMT基因启动子区CpG岛甲基化和年龄相关因素情况。 [结果] 1.CDX2基因启动子甲基化率在正常(22/42,53.38%)、TA(34/54,62.96%)、HP(70/96,72.97%)、SSA/P(46/61,75.41%)、TSA(55/68,80.88%)和CRC(69/69,100%)中呈递增趋势,结直肠锯齿状通路中CDX2基因启动子甲基化率略高于APC传统腺瘤通路。其中 CDX2基因启动子甲基化率在对照组正常组织与实验组 HP(P=0.019)、SSA/P(P=0.015)和TSA(P=0.002),对照组 CRC与实验组 HP(P=0.000)、SSA/P(P=0.000)和TSA(P=0.000),对照组TA与实验组TSA(P=0.027)均有显著性差异; CDX2蛋白表达率在正常(24/24,100%)、HP(51/52,98.07%)、SSA/P(36/41,87.80%)、TSA(19/23,82.61%)、TA(15/20,75.00%)和CRC(17/24,70.83%)中呈递减趋势,其中CDX2蛋白阳性率在对照组CRC与实验组HP(P=0.001),对照组TA与实验组HP(P=0.005),实验组HP和TSA(P=0.038)均有显著性差异;CDX2基因启动子甲基化率和CDX2蛋白阳性率的相关性比较中,实验组HP、SSA/P和TSA中P=0.652,γ=-0.064(极弱相关);P=0.238,γ=-0.182(极弱相关);P=0.519,γ=-0.142(极弱相关),但两者有负相关趋势;CDX2基因启动子甲基化频率和不同年龄层段相关性比较实验组HP、SSA/P和TSA中P=0.002,γ=0.312(弱相关);P=0.000,γ=0.473(中等程度相关);P=0.001,γ=0.392(弱相关),对照组TA中P=0.001,γ=0.440(中等程度相关); 2.MGMT基因启动子甲基化率在正常(0/42,0)、HP(25/96,26.04%)、TA(25/54,46.30%)、SSA/P(37/61,60.66%)、TSA(52/68,76.47%)中呈递增趋势,CRC(47/69,68.12%)中甲基化率略下降。其中MGMT基因启动子甲基化率在对照组正常组织与实验组SSA/P(P=0.000)和TSA(P=0.000),对照组CRC与实验组HP(P=0.000),对照组TA与实验组HP(P=0.012)和TSA(P=0.001)均有显著性差异;MGMT蛋白表达率在正常(24/24,100%)、HP(51/52,98.08%)、TA(16/20,80.00%)、SSA/P(32/41,78.05%)和TSA(16/23,69.57%)中呈递减趋势,CRC(17/24,70.83%)中蛋白表达率略上升,其中MGMT蛋白阳性率在对照组正常组织与实验组HP(P=0.001)、SSA/P(P=0.000)和TSA(P=0.000),对照组CRC与实验组HP(P=0.001),对照组TA与实验组HP(P=0.029),实验组HP与SSA/P(P=0.006)和TSA(P=0.001)均有显著性差异;MGMT基因启动子甲基化率和MGMT蛋白阳性率的相关性比较中,实验组HP、SSA/P和TSA中P=0.117,γ=-0.220(弱相关);P=0.020,γ=-0.361(弱相关);P=0.037,γ=-0.437(中等强度相关),且两者有负相关趋势;MGMT基因启动子甲基化频率和不同年龄层段相关性比较实验组 HP、SSA/P和TSA中P=0.931,γ=0.009(极弱相关);P=0.503,γ=0.087(极弱相关);P=0.263,γ=0.138(极弱相关),对照组TA中P=0.763,γ=0.042(极弱相关)。 [结论] 1.结直肠锯齿状病变中CDX2基因启动子CpG岛中上游区域甲基化程度高,蛋白表达阳性率高,两者相关性不强,极少部分甲基化状态可能有诱导 CDX2蛋白表达下调的作用;大部分甲基化可能随着年龄增加而逐渐增加。 2.结直肠锯齿状病变中MGMT基因启动子CpG岛甲基化在HP、SSA/P和TSA中呈递增趋势,MGMT蛋白表达在HP、SSA/P和TSA中呈递减趋势,MGMT基因甲基化可能导致MGMT蛋白表达下调,与结直肠锯齿状病变的发生、发展密切相关。 [背景与目的] CRC的发生与发展与癌基因和抑癌基因的缺失、扩增或突变有关。有些基因在染色体水平上发生表观遗传修饰改变也会导致表达下调。表观遗传修饰最多见的是CpG岛(CpG island)的甲基化改变。 本研究运用5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)对HT-29和LoVo细胞株作用后第一方面通过MethyLight方法分析HT-29和LoVo结直肠癌细胞株中CDX2和MGMT基因启动子区CpG岛甲基化情况;第二方面通过SYBR Green PCR方法分析HT-29和LoVo结直肠癌细胞株中CDX2和MGMT基因mRNA的表达情况;第三方面通过Western-Blot方法分析HT-29和LoVo结直肠癌细胞株中CDX2和MGMT蛋白的表达情况,在DNA、RNA和蛋白三个层面上对CDX2和MGMT进行初步探究。 [方法] 体外培养HT-29和LoVo结直肠癌细胞株,并用不同浓度(0.5、1.0、1.5μM)的5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)进行处理,并设置对照组DMSO溶剂组(0μM5-Aza-CdR)。MethyLight法检测两种细胞CDX2和MGMT基因启动子区CpG岛甲基化表达情况,SYBR Green PCR法检测及2-△△Ct法分析CDX2和MGMT基因mRNA表达情况,Western-blot技术测定及平均光密度比值分析细胞CDX2和MGMT蛋白表达情况。 [结果] 1.Methylight检测HT-29和LoVo细胞中CDX2基因DNA甲基化,在5-Aza-CdR作用后异常甲基化未得到逆转(甲基化);实时荧光定量PCR检测CDX2基因mRNA发现在5-Aza-CdR不同浓度处理后CDX2基因mRNA在两个细胞中变化不明显,HT-29细胞株相对表达量分别为(1.000±0.000),(0.973±0.024),(1.014±0.019)和(1.094±0.020);LoVo细胞株相对表达量分别为(1.000±0.000),(0.966±0.038),(1.050±0.029)和(1.007±0.019),但CDX2基因mRNA在HT-29细胞株表达(F=25.146,P=0.000)和LoVo细胞株表达(F=5.470,P=0.024)具有统计学差异;Western blot检测5-Aza-CdR处理后对照组、不同浓度实验组CDX2蛋白表达,显示在HT-29细胞株表达(F=0.438,P=0.732)和LoVo细胞株表达(F=1.370,P=0.320)统计学差异不显著。 2.Methylight检测HT-29和LoVo细胞中MGMT基因DNA甲基化状态,在5-Aza-CdR作用后异常甲基化得到逆转;实时荧光定量PCR检测到不同浓度(DMSO对照组、0.5μM、1.0μM和1.5μM实验组)5-Aza-CdR处理后MGMT基因mRNA表达上调,HT-29细胞株相对表达量分别为(1.000±0.000),(1.121±0.125),(2.307±0.254)和(3.214±0.303);LoVo细胞株相对表达量分别为(1.000±0.000),(1.118±0.021),(1.439±0.144)和(2.768±0.382),MGMT基因mRNA在HT-29细胞株表达(F=73.821,P=0.000)和LoVo细胞株表达(F=41.659,P=0.015)具有统计学意义。Western blot检测到不同浓度(DMSO对照组、0.5μM、1.0μM和1.5μM实验组)5-Aza-CdR处理后MGMT蛋白表达上调,HT-29细胞株相对表达量分别为(2.052±0.036),(2.151±0.041),(2.425±0.021)和(3.586±0.054);LoVo细胞株相对表达量分别为(1.378±0.020),(1.477±0.022),(1.642±0.027)和(2.191±0.026)。MGMT蛋白表达在HT-29细胞株表达(F=957.183,P=0.000)和LoVo细胞株表达(F=699.862,P=0.000)亦具有统计学意义。 [结论] 1.5-Aza-CdR不能够逆转结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中CDX2基因的甲基化状态,也不能使mRNA及蛋白重新表达。 2.结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中MGMT启动子甲基化可能是导致该基因表达下调甚至失活的主要原因。5-Aza-CdR能够较成功的逆转结直肠癌细胞株 HT-29和LoVo中MGMT基因的甲基化状态,并能恢复mRNA及蛋白重新表达。