肝癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,全球发病率已超过100万/年。我国一直是世界范围内的HCC高发区,其发病率约为欧美地区的10倍。肝癌因其恶性度高、病情进展快,大部分患者就诊时已为晚期,细胞毒化疗药对晚期肝癌疗效差,有效治疗尚无标准方案。因此,肝癌致病基因以及致病机理的研究对于多阶段HCC的病理诊断和针对肝癌特异靶点的药物研发尤为重要。HRP-3(hepatoma-derived growth factor related protein 3)是本室通过差异显示PCR方法筛选到的肝癌上调表达的基因,前期工作已经发现：1)HRP-3在肝癌中上调表达并激活MAPK/ERK信号通路；2)HRP-3促进肝癌细胞锚定非依赖性生长并显著提高裸鼠移植瘤生长；3)敲减内源的HRP-3能够增强HCC对肿瘤药物的敏感性。这些结果说明HRP-3在肝癌发生和发展过程中具有重要作用。在上述工作基础之上,本文就还未阐明的地方进行深入研究。首先我们利用实时定量PCR的方法追加检测了102对具有病理资料的肝癌样本,发现在肝癌中HRP-3的mRNA水平显著上调,并且与肝炎史、肿瘤大小、肿瘤数目和预后这些临床病理特征具有显著相关性；同时制备具有特异性的抗HRP-3多克隆抗体,检测肝癌组织样本中HRP-3蛋白水平的变化以及在组织学中的分布情况,结果显示HRP-3蛋白水平在癌中上调表达,且在细胞核和细胞质中均有分布；接着我们验证了多种肝癌细胞均能分泌出内源的HRP-3蛋白,并且HRP-3激活MAPK/ERK信号通路具有特异性；Brdu掺入实验表明HRP-3蛋白对于肝癌细胞的增殖没有影响,但却能够阻抑肝癌细胞发生脱巢凋亡并且这种作用是依赖于至少是部分依赖MAPK/ERK途径；进一步我们用裸鼠成瘤的瘤体从活体水平上证明HRP-3分别与存活指标p-ERK和增殖指标Ki67的表达呈正相关,与凋亡指标TUNEL的表达程度呈负相关；最后我们研究了HRP-3调节MAPK/ERK的机制,发现HRP-3在EGF刺激条件下能够由胞核转向胞质分布并与RAF、MEK、ERK相互作用。此外HRP-3还参与调控无糖条件下肝癌细胞的存活,提高肝癌细胞对能量压力的耐受。这项研究揭示了HRP-3与肝癌临床病理特征的相关性,同时报道了HRP-3通过正向调节MAPK/ERK信号通路抑制肝癌细胞发生脱巢凋亡,促进肿瘤的发生和发展。这些研究结果为针对特异性细胞外受体或细胞内信号转导途径的药物的研发提供了依据,并且HRP-3本身也可以作为肝癌诊断和治疗的特异性靶标。TGF-β (transforming growth factor β)是一个多效因子,在肿瘤发生的起始阶段起抑制肿瘤生长的作用,而在进展期和晚期TGF-p转而呈现促使肿瘤细胞生长和转移的作用。TGF-β信号通路中任何成员的表达变化或者该信号通路失调都会致使肿瘤的发生和发展。HEY2 (hairy and Enhancer-of-split related whith YRPW motif)基因是在哺乳动物中发现的一个Hairy相关基因,它是Notch通路的效应基因,编码的蛋白能够行使转录抑制功能；HEY2在胚胎发育、心血管发生中具有重要作用；在心脏中HEY2特异表达于心室,与HEY1共同调节心脏房室边界形成；目前仅发现HEY2在骨肉瘤中上调表达。我室在研究肝癌相关基因的过程中通过酵母双杂发现HEY2能够与TGF-p信号通路上的重要转导因子Smad3相互作用,于是开展相关工作对于HEY2调节TGF-β信号通路以及在肝癌发生发展过程中的作用进行初步探索。我们首先采用Pull Down的方法检测了HEYs与Smads家族各成员间的互作,发现HEY2能够与Smad3、Smad4相互作用,并用Co-IP证实了HEY2分别与二者在体内形成共复合物且共定位于细胞核中。接着我们在肝癌中研究了HEY2的功能。用双萤光酶报告系统证实,在肝癌细胞中HEY2显著抑制Smad3/4的对下游SBE报告基因的激活；并且能够参与TGF-β信号通路,阻抑TGF-β对下游靶基因c-Myc的抑制作用。为了进一步研究HEY2的生物学功能,我们选用肝癌细胞Hep3B系构建了超量表达HEY2的稳定株,利用MTS和克隆形成率方法证实,稳定表达HEY2对肝癌细胞的正常生长没有影响；但在TGF-β因子刺激条件下,稳定表达HEY2的肝癌细胞株较之对照组细胞显著地抵抗TGF-β对细胞活力和生长的抑制。最后我们通过Western Blot和免疫组化实验检测了HEY2蛋白水平在肝癌组织中的表达,结果显示HEY2在人肝癌样本中显著上调表达；组化分析还发现,HEY2在细胞核中的表达增多可能是肝癌的发生和发展的一个因素。综上结果,HEY2能够通过参与调控TGF-β信号通路在肝癌的发生和发展过程中发挥一定的作用。这项研究提示了转录因子HEY2发挥功能的一种新的作用方式,并且第一次报道了HEY2在肝癌的发生和发展的作用。