脑源神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)/酪氨酸受体激酶B(Tropomyosin receptor kinase B,TrkB)信号级联对于大脑神经的突触可塑性和学习记忆功能是必不可少的。与同龄健康人群相比,BDNF蛋白在罹患阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)的病人大脑中的表达量大幅减少。临床实验表明,补充外源性BDNF能够缓解AD病人的病情恶化,然而,作为大分子蛋白,BDNF自身难以穿越血脑屏障,无论经口摄入还是直接注射,都无法进入大脑发挥作用,有着无法逾越的药代动力学障碍。7,8-二羟基黄酮(7,8-dihydroxyflavone,7,8-DHF),是一种天然存在的黄酮类化合物。大量研究表明,7,8-DHF能够穿越血脑屏障,作为TrkB的激动剂,专一性结合TrkB,有效地模拟BDNF的生理作用。然而,7,8-DHF在人体内生物利用度有限,为了最大发挥其作为TrkB激动剂的作用,本研究采用衍生化策略,通过对活性基团的修饰保护来改善原体药物在体内的药代动力学特性(Pharmakenetics,PK),采用AD模型小鼠5XFAD进一步验证所合成衍生物的药效。试验证明,经体外试验所筛选出的最佳衍生物R13能够延长7,8-DHF在体内的半衰期,增加其生物利用度及脑暴露水平。最为重要的是,R13通过有效地激活TrkB信号通路,进而抑制在AD发病机制中起关键作用的天冬酰胺内肽酶(Asparaginylendopeptidase,AEP)的活性,延缓AD病程的发展。R13作为7,8-二羟基黄酮的前药,表现出作为治疗AD药物的巨大潜能。本项目具体研究内容及结果如下:(1)合成一系列7,8-DHF衍生物,鉴定具有最优体外药代动力学特性的前药。对7,8-DHF中苯环酚羟基进行侧基化学结构修饰来合成一系列衍生化合物,并对化合物进行了化学稳定性、肝微粒体和血浆稳定性以及Caco-2细胞渗透性测定。在20种衍生物中,只有R5、R7、R13、R16、R17和R18在肠微粒中相对稳定并能够在肝微粒体和血浆中水解。然而,R7在人肝微粒体中几乎不产生游离的7,8-DHF,且R16和R17在肝微粒体中未能释放出7,8-DHF。R18的Caco-2细胞渗透性差,意味其体内吸收率低,也不适于作为前药。综上,体外筛选试验数据支持R13作为体内药代动力学研究的唯一合适候选药物。(2)采用C57BL/6小鼠进行灌胃试验,对比R13和7,8-DHF在体内的药代动力学特性及穿越血脑屏障的能力。药代动力学研究结果表明,单次摄入75 mg/kg.bw R13后,7,8-DHF的的最大血药浓度Cmax平均值为129 ng/mL,血药达峰时间Tmax为30 min,药物浓度-时间曲线下面积(Area under the curve,AUC)为14777.5 min.ng/mL。R13的摄入绝对生物利用度平均值为10.5%,摄入R13后,血液中7,8-DHF的分布半衰期为219.6 min,而摄入当量7,8-DHF后,血液中7,8-DHF的分布半衰期为134min。药物穿越血脑屏障能力研究结果表明,单次摄入72.5mg/kg.bw的R13后,7,8-DHF的最大血药浓度为56ng/mL,达峰时间2h;最大脑暴露浓度为46ng/mL,达峰时间为4h,均高于单次摄入当量7,8-DHF后所测值。综上,与7,8-DHF相比,前药R13具备更好的药物特性。(3)研究长期摄入R13对AD模型小鼠5XFAD脑部神经元TrkB及其下游信号通路的激活效果,对神经元突触变少的减缓作用。结果表明,与摄入载体对照组相比,长期摄入R13能明显促进TrkB的磷酸化,从而激活下游的AKT和ERK/MAPK信号通路,逆转突触密度的下降趋势,且该效应呈剂量依赖特性。(4)研究长期摄入R13对AD模型小鼠5XFAD大脑神经元AEP激活的抑制作用及机制,遏制由AEP剪切的淀粉样蛋白前体蛋白(Amyloid precursor protein,APP)片段及Tau蛋白片段的生成,减少神经炎症的效果。试验结果表明,与摄入载体的对照组相比,长期摄入R13能明显抑制大脑神经元AEP的活性并阻断APP和Tau蛋白的病理性片段化,降低大脑炎症因子水平,且该效应呈现剂量依赖特征。(5)研究长期摄入R13能减少淀粉样蛋白在AD模型小鼠5XFAD脑部沉积,改善记忆功能。结果表明,与摄入载体对照组相比,长期摄入R13能明显阻断海马和皮质中的Aβ沉积,降低大脑中总Aβ水平,从而挽救5XFAD小鼠的记忆功能衰退,并且对AD病程的减缓作用呈现剂量依赖的特性。(6)采用21.8 mg/kg.bw/day的R13灌胃剂量对2个月的AD模型小鼠5XFAD进行灌胃试验,初步评价长期摄入R13的毒性。结果表明,长期摄入R13对小鼠体重无显著影响,小鼠主要脏器及骨髓细胞形态并未出现变化,血液中主要指标也未改变,表明R13毒性低,按当前剂量长期摄入R13是安全的。