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抗生素耐药性已成为日益严重的公共卫生威胁,引发全球性健康危机。抗生素的滥用刺激了抗生素耐药细菌(ARB)和抗性基因(ARGs)更快的出现,并且污水作为抗生素污染物的主要载体,导致畜禽养殖场、污水处理厂、医院、制药厂成为ARB和ARGs的天然储存库,如不采取有效的应对措施,ARB和ARGs将在各类水体中广泛流行。国内外有关ARGs的相关研究多集中在ARGs的污染源筛查和单一处理工艺的去除效果。因此开展针对封闭环境中的细胞培养废液和相对开放环境中的畜禽养殖场和动态污水处理系统中的ARB与ARGs的关联分析,找出各污染系统中关键微生物与指示基因,从而探究控制ARGs传播的主要消毒工艺手段,并阐明紫外/氯组合工艺对ARB与ARGs的控制机制研究尤为必要。
针对细胞培养废液、畜禽养殖场污水和各类污水处理系统中的微生物多样性和ARGs的污染特征分别进行分析,其中细胞培养废液中微生物多样性和ARGs总量均远低于后两者。且通过比较高校和医院两类细胞实验室内废液的差异,发现医院实验室废水的微生物的多样性、ARGs检出率和总量显著高于高校实验室,应引起生物科研人员重视。进一步比较各类畜禽养殖场污水,显示微生物多样性奶牛场>养猪场>养鸡场,而抗性基因检测结果表明ARGs污染丰度却是养猪场>奶牛场>养鸡场,显然养猪场的ARGs污染程度更高。最后分别对医院、市政和制药的动态污水处理系统进行分析,结果显示微生物多样性:市政污水>医院污水>制药污水,而抗性基因污染程度:医院污水>制药污水>市政污水,表明医院污水ARGs污染风险更高。并且通过分析动态污水处理系统抗性基因丰度和种类变化,发现次氯酸盐和紫外消毒工艺处理对ARGs种类和丰度具有削减作用。
通过建立不同高风险源ARGs和可移动遗传元件(MGEs)的共现模式。初步发现转座子IS613和Tp614均参与了细胞培养废液和畜禽养殖污水中抗性基因的水平转移过程,而动态污水处理系统中参与ARGs的水平转移的MGEs主要为转座子Tn23、Tn24和Tn25。此外确立了各类风险源中的污染指示基因,细胞培养废液为qacE-02,畜禽养殖污水为blaPER和sul2,污水处理系统中为tetC、strB和ermC。结合微生物丰度组成数据,明确细胞培养废液中污染指示微生物为肠球菌属、脱硫弧菌属和产碱菌属,畜禽养殖污水指示微生物为链球菌属、苏黎世杆菌属和泰氏菌属,而动态污水处理系统指示微生物菌属有束毛球菌属、丝硫菌属、链球菌属和Reyranella属。进一步通过冗余分析,发现抗性基因作为内在因子,影响微生物在各类污水中的群落组成。
最后,从各污水源经过严格的单克隆平板筛选,获得抗性差异较大的革兰氏阳性菌(粪肠球菌)和革兰氏阴性菌(摩氏摩根菌)。通过实验室配水,探讨了不同剂量下的紫外/氯组合消毒削减ARB和ARGs的研究。在细菌失活剂量(4-32 mJ/cm2)下,在紫外反应体系中添加少量的氯(剂量1-2mg/L),显著提升ARB的灭活率(0.8-1.4 log),且能有效抑制细菌光复活现象,避免紫外消毒可修复的缺点;随着剂量的提升,在基因削减剂量(≥40mJ/cm2)下,紫外/氯组合消毒可提高ARGs削减率(0.3-1.5 log);进一步探讨在非致死剂量(UV≤4mJ/cm2,chlorine≤2mg/L)下,发现紫外抑制RP4质粒接合转移,而氯剂量为0.5mg/L时,负责质粒接合转移的Ⅳ型分泌系统(T4SS)相关蛋白的表达水平提高,促进ARGs水平转移能力提升。同时发现UV<4mJ/cm2反应体系中投加1-2mg/L氯,共轭接合转移频率下调。因此,紫外/氯组合消毒工艺可协同削减ARB和ARGs,并抑制抗性基因的水平转移。
综上所述,我们的结果揭示了细胞培养废液、畜禽养殖场和动态污水处理系统中的ARB与ARGs的分布特征,明确了不同类别污水下调控基因水平转移的可移动遗传元件,并探明了不同污水中的指示微生物和抗性基因,为各类污水中抗性基因的检测奠定了分子基础。在此过程中发现了消毒削减ARGs的实质,并通过建立实验室ARGs削减模型,阐明了紫外/氯组合消毒工艺削减ARGs的丰度及阻遏水平转移的机制,为污水中ARGs的控制提供了新的方法和理论基础。
针对细胞培养废液、畜禽养殖场污水和各类污水处理系统中的微生物多样性和ARGs的污染特征分别进行分析,其中细胞培养废液中微生物多样性和ARGs总量均远低于后两者。且通过比较高校和医院两类细胞实验室内废液的差异,发现医院实验室废水的微生物的多样性、ARGs检出率和总量显著高于高校实验室,应引起生物科研人员重视。进一步比较各类畜禽养殖场污水,显示微生物多样性奶牛场>养猪场>养鸡场,而抗性基因检测结果表明ARGs污染丰度却是养猪场>奶牛场>养鸡场,显然养猪场的ARGs污染程度更高。最后分别对医院、市政和制药的动态污水处理系统进行分析,结果显示微生物多样性:市政污水>医院污水>制药污水,而抗性基因污染程度:医院污水>制药污水>市政污水,表明医院污水ARGs污染风险更高。并且通过分析动态污水处理系统抗性基因丰度和种类变化,发现次氯酸盐和紫外消毒工艺处理对ARGs种类和丰度具有削减作用。
通过建立不同高风险源ARGs和可移动遗传元件(MGEs)的共现模式。初步发现转座子IS613和Tp614均参与了细胞培养废液和畜禽养殖污水中抗性基因的水平转移过程,而动态污水处理系统中参与ARGs的水平转移的MGEs主要为转座子Tn23、Tn24和Tn25。此外确立了各类风险源中的污染指示基因,细胞培养废液为qacE-02,畜禽养殖污水为blaPER和sul2,污水处理系统中为tetC、strB和ermC。结合微生物丰度组成数据,明确细胞培养废液中污染指示微生物为肠球菌属、脱硫弧菌属和产碱菌属,畜禽养殖污水指示微生物为链球菌属、苏黎世杆菌属和泰氏菌属,而动态污水处理系统指示微生物菌属有束毛球菌属、丝硫菌属、链球菌属和Reyranella属。进一步通过冗余分析,发现抗性基因作为内在因子,影响微生物在各类污水中的群落组成。
最后,从各污水源经过严格的单克隆平板筛选,获得抗性差异较大的革兰氏阳性菌(粪肠球菌)和革兰氏阴性菌(摩氏摩根菌)。通过实验室配水,探讨了不同剂量下的紫外/氯组合消毒削减ARB和ARGs的研究。在细菌失活剂量(4-32 mJ/cm2)下,在紫外反应体系中添加少量的氯(剂量1-2mg/L),显著提升ARB的灭活率(0.8-1.4 log),且能有效抑制细菌光复活现象,避免紫外消毒可修复的缺点;随着剂量的提升,在基因削减剂量(≥40mJ/cm2)下,紫外/氯组合消毒可提高ARGs削减率(0.3-1.5 log);进一步探讨在非致死剂量(UV≤4mJ/cm2,chlorine≤2mg/L)下,发现紫外抑制RP4质粒接合转移,而氯剂量为0.5mg/L时,负责质粒接合转移的Ⅳ型分泌系统(T4SS)相关蛋白的表达水平提高,促进ARGs水平转移能力提升。同时发现UV<4mJ/cm2反应体系中投加1-2mg/L氯,共轭接合转移频率下调。因此,紫外/氯组合消毒工艺可协同削减ARB和ARGs,并抑制抗性基因的水平转移。
综上所述,我们的结果揭示了细胞培养废液、畜禽养殖场和动态污水处理系统中的ARB与ARGs的分布特征,明确了不同类别污水下调控基因水平转移的可移动遗传元件,并探明了不同污水中的指示微生物和抗性基因,为各类污水中抗性基因的检测奠定了分子基础。在此过程中发现了消毒削减ARGs的实质,并通过建立实验室ARGs削减模型,阐明了紫外/氯组合消毒工艺削减ARGs的丰度及阻遏水平转移的机制,为污水中ARGs的控制提供了新的方法和理论基础。