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前言胃癌是源自胃粘膜上皮的恶性肿瘤,在我国发病率及死亡率很高。胃癌涉及到多种癌基因的激活及抑癌基因的失活,揭示这些基因变化的规律,不仅可以阐明癌变的机制,更可以协助肿瘤的诊断、治疗和预后。近年来,miRNA分子对基因表达的调控作为肿瘤发生发展的又一可能原因,受到越来越多的关注。MicroRNAs是长约21-25个核苷酸的小RNA分子,在真核生物中发挥基因表达调控作用,通过调节肿瘤相关基因的表达,参与肿瘤的发生发展。本实验室前期利用多重连接依赖式探针扩增(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA)技术对50例胃癌组织进行基因组水平的分析,发现有58%的病例存在染色体1p36区域的缺失,提示该区域可能存在胃癌特异性的抑制基因或调控序列。人类miR-200a定位于染色体1p36区,在乳腺癌、卵巢癌及结肠癌细胞中已证实miR-200a通过抑制转录因子ZEB2的表达,间接调节E-cadherin的表达,抑制肿瘤细胞的迁移,抑制上皮向间质转化(Epithelial to mesenchymal transition, EMT),但在胃癌中miR-200a的作用及可能的作用途径尚不清楚。E-cadherin是细胞粘附分子cadherin家族成员,对于上皮的形成和维持具有重要作用,其功能缺失与肿瘤的侵袭和转移有关。有研究表明：E-cadherin参与调控EphA2与其配体的结合及后续降解,EphA2的功能活化也依赖于适当的E-cadherin蛋白表达及功能定位。EphA2在许多肿瘤组织中呈过度表达,尤其高表达于高侵袭性的肿瘤细胞。新近研究发现EphA2在胃癌组织中高表达,且与胃癌的侵袭和淋巴转移相关。本研究以胃癌MGC803细胞为研究对象,试图探讨胃癌中miR-200a的作用及可能参与的信号途径,以期为胃癌发生发展的研究提供一定的实验依据。材料与方法1、化学合成的miR-200a及相应阴性对照(Negative control, NC) mimics miR-200a:5’-UAACACUGUCUGGUAACGAUG U-3’; Negative control:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’2、miR-200a及NC转染MGC803细胞,使miR-200a过表达,应用steam-loop RT-PCR检测转染后表达效率。3、转染niRNA mimics 24及48h,利用TRIzol法提取总RNA,反转录合成cDNA,应用实时定量RT-PCR检测ZEB2、E-cadherin、EphA2的mRNA表达。4、转染miRNA mimics 24及48h,应用western blot方法检测E-cadherin、EphA2的蛋白表达。5、应用MG1 32阻断蛋白降解,分析miR-200a对EphA2降解的调节。实验结果1、miR-200a及NC mimics转染后表达效率的检测经steam-loop RT-PCR检测,转染miR-200a组中miR-200a的表达为转染NC组的1838±5.3倍,表明miRNA片段转染后成功高效表达。2、胃癌细胞MGC803中miR-200a对ZEB2表达的调节MGC803细胞转染miR-200a 24 h,转染miR-200a组ZEB2的表达量为对照组的0.7倍；转染后48 h,转染miR-200a组ZEB2的表达量为对照组的0.71倍。3、胃癌细胞MGC803中miR-200a对E-cadherin表达的调节MGC803细胞转染miR-200a 24及48h,转染miR-200a组E-cadherin表达均高于对照组。在RNA水平,实验组E-cadherin表达量约为对照组的2.381、6.337倍；在蛋白水平,实验组E-cadherin表达量约为对照组的1.57、5.43倍。4、胃癌细胞MGC803中miR-200a对EphA2表达的调节MGC803细胞转染miR-200a 24h后,转染miR-200a组EphA2表达明显高于对照组。在RNA水平,实验组EphA2表达量约为对照组的4.78倍；在蛋白水平,实验组EphA2表达量约为对照组的3.4倍。而48h后转染miR-200a组EphA2表达略高于对照组。在RNA水平,实验组EphA2表达量约为对照组的1.39倍。在蛋白水平,实验组EphA2表达量约为对照组的1.12倍。5、miR-200a可部分抵消MG132介导的EphA2降解抑制蛋白酶体抑制剂MG132可明显抑制EphA2的降解,转染NC的MG132处理组EphA2的表达量约为对照组的2.83倍；而转染miR-200a后,未见EphA2明显的降解抑制,MG132的作用被部分抵消,使得MG132处理组EphA2的表达量约为对照组的0.93倍。结论1、在胃癌细胞MGC803中,miR-200a通过抑制ZEB2的表达,诱导E-cadherin的表达。2、在胃癌细胞MGC803中,miR-200a表达增加可导致转染后24h,EphA2的表达明显增加,而在48h这种表达增加不明显。3、MGC803细胞转染miR-200a及NC 24-48h,miR-200a激活了EphA2的降解。