前言：　　 疟疾是由疟原虫感染引起的最为严重的寄生原虫感染性疾病。大量与疟疾有关的研究结果表明遗传因素影响疟疾的发生、发展、严重程度以及结局。人类控制疟疾易感性的遗传成分是十分复杂的。使用遗传背景十分明确的近交系,重组近交系或重组同类系小鼠来代替人类进行疟疾易感性的遗传研究,可以较为方便地分离控制疟疾易感性的复杂遗传因素,并在数量足够大的样本中进行连锁相关分析。寻找和确定小鼠的疟疾易感基因将为在人类中确定同源基因奠定基础。　　 不同近交系小鼠针对同一种病原体感染的易感性不同,这种差异来源于遗传背景的不同。因此,可以利用不同鼠系间疟疾感染表型的差异来寻找控制宿主易感性的基因,并通过对易感基因的功能分析揭示宿主的保护机制。近十余年来,已经有几个小组利用夏氏和伯氏疟原虫感染的小鼠模型,确定了十多个影响原虫血症水平和脑疟表型的易感位点。尚未见到利用BALB/c和DBA2小鼠对P.y17XL易感性进行遗传连锁分析的报道,由于不同株系疟原虫引起的致病机制和宿主保护性应答机制不同,为更全面地了解影响宿主易感性的遗传因素,有必要对BALB/c和DBA2小鼠携带的疟疾易感或抵抗等位基因进行定位和克隆。　　 我们在前期工作中通过观察BALB/c与DBA2杂交子一代C.DF1小鼠的表型,发现C.DF1小鼠感染P.y17XL后的原虫血症水平和生存率等方面的表型与其父系DBA2小鼠基本一致,与母系BALB/c小鼠间存在极为显著的差异,即F1小鼠中DBA2来源的疾病相关等位基因以显性方式起作用。据此,我们建立了BALB/c×(BALB/c×DBA2)回交小鼠C.DN2模型,并对回交小鼠19条常染色体上的多态性微卫星遗传标记进行了基因型分析,通过数量性状位点分析,确定了控制P.y17XL感染后原虫血症水平的三个遗传位点,为进一步克隆BALB/c与DBA2小鼠来源的约氏疟原虫易感/抵抗等位基因奠定基础。　　 实验方法：　　 1、实验动物、疟原虫及主要试剂　　 6～8周雌性BALB/c,雄性DBA2小鼠,SPF级,由中国医学科学院实验动物研究所提供(许可证编号:SCXK京200420001)。致死性约氏疟原虫P.y17XL,由中国医科大学免疫教研室曹雅明教授惠赠。PCR试剂购自北京宝生物(Takara),微卫星遗传标记由北京天根合成。　　 2、繁育动物及感染　　 由雌性BALB/c小鼠与雄性DBA2小鼠杂交得到的C.DF1小鼠再与雌性BALB/c小鼠交配得到回交小鼠C.DN2。6～8周回交小鼠经腹腔注射2×106PRBC。感染后第3天开始,尾静脉采血,制备薄血膜,Giemsa染色,动态监测原虫血症水平并每日观察生存率。　　 3、脾细胞培养　　 C.DN2小鼠于感染第5天无菌摘取脾脏,常规方法制备脾细胞悬液,用含10%FCS的RPM11640调整脾细胞终浓度至1×107个/ml,于24孔培养板(Costar)中,每孔加入500ul细胞悬液,一式4孔,培养48h。收集培养上清,于-80℃保存。　　 4、微卫星遗传标记的筛选　　 根据MGI数据库所提供的信息,在BALB/c和DBA2间有多态性的微卫星遗传标记,选择常染色体上的大概相距20cM,分辨率在4bp以上的多态性微卫星标记。　　 5、基因型分析　　 碱裂解法提取鼠尾尖组织DNA,PCR扩增后,于4%的琼脂糖凝胶上电泳分离,根据扩增片段长度多态性(AFLP)进行微卫星遗传标记的基因型分析。　　 6、统计学处理　　 将表型数据和基因型数据输入MAPMANAGER软件。标本采用独立样本t检验对数据做统计分析。　　 实验结果：　　 1、R.y17XL感染后,BALB/c、DBA2和C.DF1小鼠的生存率及原虫血症水平的比较　　 BALB/c小鼠于感染后的第6-7天全部死亡,DBA2小鼠感染后第10天的生存率为75%,C.DF1小鼠则为100%。经P.y17XL感染后,BALB/c小鼠原虫血症水平迅速攀升,于第6天达到峰值75.42%;DBA2和C.DF1小鼠原虫血症水平上升缓慢,一直保持在8%以下。BALB/c组与DBA2和C.DF1组间差距明显,并且有统计学意义。　　 2、控制P.y17XL感染后C.DN2小鼠原虫血症水平的QTLs的染色体定位　　 控制感染后第4天原虫血症水平的QTL与小鼠第11号染色体18.51cM处遗传标记D11Mitl34肯定连锁;控制感染后第5天原虫血症水平的QTL与小鼠第3号染色体66.69cM处遗传标记D3Mit258和第15号染色体59cM处遗传标记D15Mit35肯定连锁。　　 3、QTL对性状的影响　　 感染后第4天,D11Mitl34上回交小鼠基因型为C型的原虫血症水平为29.32%,高于H型组的原虫血症水平22.61%,无显著性差异,P=0.15。上述结果提示BALB/c来源的与DllMitl34紧密连锁的QTL能促进CDN2小鼠感染P.y17XL后原虫血症水平的升高。　　 感染后第5天,在D3Mit258上,回交小鼠基因型为C型的原虫血症水平为36.75%,明显低于基因型是H型的原虫血症水平51.18%(P＜0.05);在D15Mit35上,C型的原虫血症水平为41.77%,低于H型组的原虫血症水平50.32%,但无显著性差异,P=0.14。上述结果提示BALB/c来源的与D3Mit258、D15Mit35紧密连锁的QTL可能抑制CDN2小鼠感染P.y17XL后的原虫血症水平。　　 结论：　　 1、控制C.DN2小鼠感染P.y17XL后原虫血症水平的QTLs与遗传标记D3Mit258、D11Mit134和D15Mit35连锁。　　 2、BALB/c小鼠来源的与D3Mit258和D15Mit35连锁的QTLs,DBA2小鼠来源的与D11Mit134连锁的QTL对P.y17XL的感染起抵抗作用。