氨基酰-tRNA合成酶(Aminoacyl-tRNA synthetase，AARS)是在蛋白质合成过程中负责催化将特定的氨基酸转移到相应的转运核糖核酸(tRNA)分子的氨基酸接受臂上的酶家族。生物体将基因的遗传密码正确翻译为执行功能的蛋白质的过程在很大程度上依赖于AARS催化的tRNA的氨基酰化反应。该类酶中十七种酶催化的氨基酰化反应分为氨基酸的活化和tRNA的氨基酰化两步反应。一般而言，对于二十种基本氨基酸，每一种氨基酸及相应的tRNA均被特定的AARS所特异性识别。按照活性中心的结构特点，二十种AARS被分为两类，每一类含有十种，每类AARS又被分为三个亚类。目前，对于原核生物的AARS的结构与功能研究得比较清楚，而对真核生物(尤其是来源于高等真核生物如哺乳动物)的AARS的结构与功能的研究相对较少。 色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)属于第Ⅰ类第三亚类的AARS。人源TrpRS(hTrpRS)与原核生物的TrpRS在氨基酸序列和三级结构上存在显著差异，特别是在底物结合位点和催化活性中心入口处的重要氨基酸位点和结构单元，提示真核生物的。TrpRS在底物的识别机制和氨基酰化反应的催化机理上存在不同之处。生化实验表明，真核和原核生物的TrpRS对tRNATrp的识别具有种属特异性，但是具体的识别机制不清楚。此外，hTrpRS比原核生物的TrpRS在N端多一段约150个氨基酸组成的额外结构域，其他真核生物和古细菌的TrpRS也含有长度不等的N端额外序列。研究结果表明N-端的额外结构域参与了氨基酰化反应过程，但是具体的功能及作用机制不清楚。 在前期的研究工作中，实验室测定了hTrpRS的未结合底物的晶体三维结构。在此基础上，本研究解析了一系列酶与底物(Trp和ATP)、底物类似物以及tRNATrp的复合物的晶体结构，包括hTrpRS-Trp的二元复合物、hTrpRS-TrpNH2O-ATP的三元复合物、hTrpRS-TrpAMP的二元复合物和hTrpRS-Trp-tRNATrp的三元复合物，分别代表了氨基酰化反应过程中酶的不同中间状态的构象。研究表明，在氨基酰化反应过程中，hTrpRS通过诱导契合的机制发生了底物结合有关的整体构象变化，具有开放和关闭的两种整体构象；同时底物结合口袋具有开放、半关闭和关闭的三种不同构象。这些构象的变化主要与底物结合口袋附近的保守序列KMSAS和AIDQ的构象变化有关，并且不同底物的结合所引起的构象变化是不同的。在此基础上，进一步研究了hTrpRS催化tRNATrp氨基酰化反应的分子机理。 这些结合不同底物的复合物的结构揭示了hTrpRS参与底物Trp、ATP和tRNATrp的特异性识别以及催化反应的重要结构单元和氨基酸位点，特别是位于底物结合口袋附近的三段保守序列AIDQ、KMSAS和HVGH。在此基础上，通过构建多种重要氨基酸的突变体和进行相关的酶学实验，进一步验证了它们的功能。结构和生化的数据都表明hTrpRS采用了不同于原核TrpRS的底物特异性识别机制。 对于色氨酸的识别，hTrpRS利用两个保守的氨基酸Tyr159和Gln194通过疏水作用和氢键作用特异性地识别了色氨酸的侧链吲哚环。在细菌Bacillus stearothermophilus TrpRS(bTrpRS)中，这两个氨基酸位点分别对应于Phe5和Cys38，其中Phe5发挥了与Tyr159相似的作用，而Cys38不存在相似的作用方式；与此同时，bTrpRS利用另外的氨基酸Asp132通过氢键作用识别了Trp的侧链吲哚环。对于ATP的识别，hTrpRS利用保守序列KMSAS的Ser351特异性地识别了ATP的α-和β-磷酸基团。对于bTrpRS，α-和β-磷酸基团主要是被保守序列KMSAS的第二个赖氨酸Lys195所特异性地识别。在真核生物的TrpRS中，这个保守的Lys被Ala所取代，因此本研究推测在真核生物的TrpRS中，可能由同样位于保守序列KMSAS的Ser351替代了缺失的第二个Lys的作用。此外，远离保守序列KMSAS的氨基酸Arg162通过盐键作用于ATP的γ-磷酸基团，参与了ATP的识别，相似的作用方式在bTrpRS对ATP的识别方式中没有发现。 hTrpRS-Trp-tRNATrp的三元复合物的结构是第一个TrpRS与tRNATrp的复合物的结构，因此首次揭示了TrpRS对tRNATrp的特殊结合方式，特别是对tRNA分子上氨基酸接受臂和反密码子环的重要碱基的特异性识别方式。研究表明，每个tRNATrp与二聚体hTrpRS的两个单体发生相互作用：反密码子环与一个单体的C端结构域结合，而另一端的氨基酸接受臂插入另一个单体的催化活性中心。 hTrpRS是从大沟方向结合tRNATrp的氨基酸接受臂，采用了Ⅱ类AARS结合tRNA的氨基酸接受臂的特征方式。由于bTrpRS与hTrpRS的整体结构非常相似，因此基于hTrpRS-Trp-tRNATrp的结构信息，通过预测bTrpRS对tRNATrp的反密码子环和氨基酸接受臂的识别方式，提出了TrpRS对于tRNATrp的种属特异性识别的分子机制。hTrpRS的N端结构域参与了tRNATrp的氨基酸接受臂的识别和结合，特别是三个重要的氨基酸Asp99、Lys102和Arg106特异性识别真核tRNATrp保守的73 A，而不能识别原核tRNATrp保守的73 G。另一方面，bTrpRS可能采取了类似于TyrRS对tRNA的氨基酸接受臂的识别方式，利用催化结构域的重要氨基酸识别tRNATrp的氨基酸接受臂，而这些氨基酸位点在真核和原核生物的TrpRS中具有明显的差别。此外，由于TrpRS和TyrRS的结构与功能具有很高的同源性，通过比较两者对各自tRNA的识别方式，进一步揭示了Ic亚家族AARS对不同种类tRNA的特异性识别的分子机制。 对于hTrpRS的N端额外结构域的结构与功能，研究表明位于83-93位的β-hairpin结构对于hTrpRS的氨基酰化反应是必需的，而且发现它是通过影响第一步氨基酸激活反应中ATP的结合以及中间产物TrpAMP的稳定来发挥作用的。 对hTrpRS的结构与功能的研究，有助于进一步揭示真核TrpRS的氨基酰化反应的催化机理和底物特异性识别机制，并且为研究不同种属的TrpRS之间的进化关系提供结构基础。此外可以利用真核生物和原核生物(特别是细菌和致病菌)TrpRS的结构和功能的差异，选择合适的靶点进行抗炎和抗菌药物的设计。