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沙糖桔(十月桔)是广东最优良的地方柑桔品种之一,但原有的有籽沙糖桔由于种子太多削弱了它的竞争力,限制了其进一步发展。导师所在的课题组通过芽变选种选育出了一个优良的无籽芽变品种一无籽沙糖桔。研究无籽沙糖桔的无籽成因必将促进沙糖桔生产的进一步发展,此外在无籽基因的获得及果树无核育种上也都具有特别重要的意义。
本研究以无籽沙糖桔无性一代(V1)、二代(V2)和三代(V3)为主体材料,同时以有籽沙糖桔、台湾桠柑、春甜桔和清见桔橙为对照或辅助研究材料进行实验。
采用海德汉铁矾苏木精法进行了花粉母细胞减数分裂观察,并且进行了花粉大小形态观察、花粉生活力和发芽力以及田间授粉实验,用以研究无籽沙糖桔的雄性育性;通过酶解压片法和常规石蜡切片法研究了无籽沙糖桔的胚囊育性及无籽沙糖桔自交和异交(无籽沙糖桔×台湾桠柑、无籽沙糖桔×有籽沙糖桔)的胚胎发育;用荧光显微镜法观察了无籽沙糖桔自交和异交(无籽沙糖桔×台湾桠柑、无籽沙糖桔×有籽沙糖桔)的授粉受精过程,统计了无籽沙糖桔人工授粉和自然授粉后自交和异交果实的平均单果种子数,统计了无籽沙糖桔单性结实的座果率,由此对无籽沙糖桔的自交和异交亲和性进行了测定,并且分析了无籽沙糖桔的单性结实能力;应用RAPD(RandomAmplifiedPolymorphismDNA,随机扩增多态性DNA)分子标记分析了无籽沙糖桔和有籽沙糖桔的遗传差异及无籽沙糖桔无性一代、二代和三代之间的遗传稳定性。研究结果表明:
1.无籽沙糖桔花粉母细胞减数分裂正常,花粉生活力和发芽力均较强;其花粉形态大小与有籽沙糖桔的花粉形态大小差异不显著,并不表现畸形和巨大性;其雄配子体发育正常,且育性较强。雄性不育不是无籽沙糖桔无籽的原因。
2.无籽沙糖桔胚囊育性正常,且不具胚胎中途败育现象。成熟胚囊具一个卵细胞、两个助细胞、三个反足细胞以及一个大的含二个极核的中央细胞。其异交的胚胎发育正常,授粉后2周出现球形胚和少量心形胚,3周后出现心形胚和鱼雷形胚,4周后全部为鱼雷形胚,5周后发育成子叶胚,7周后子叶胚仍在继续发育成种子,仍具珠柄,最终发育形成饱满种子;而其自交授粉后2周就已出现大部分胚珠的退化,并在4周后出现胚珠完全退化消失,最终形成无籽果实。
3.无籽沙糖桔自交授粉后花粉管在柱头和花柱中能正常生长,但在子房中花粉管开始自身盘绕生长,无法进入珠孔,并且向着远离胚珠的子房底部盘绕生长;而无籽沙糖桔异交授粉后花粉管在柱头、花柱和子房中都能正常生长,并能正常进入胚珠实现受精。由此证实无籽沙糖桔无籽的主要原因是自交不亲和,自交不亲和部位在子房,属于配子体型自交不亲和。
4.无籽沙糖桔自交或隔离种植时,无籽性状保持稳定;若人工异交授粉或与其它雄性正常柑桔品种混栽时会表现出有籽,且结籽率较高。生产上要注意单一品种种植或隔离种植。
5.对无籽沙糖桔(Vl、V2和V3)和有籽沙糖桔进行了RAPD分析,筛选了1196条随机引物,从中只筛选出2条有差异条带的引物,其中引物OP-AWl6在无籽沙糖桔Vl、V2和V3代中都扩增出一条相同的特异性条带,而有籽沙糖桔缺少这一条带;引物OP-BCl9在有籽沙糖桔中扩增出一条特异性条带,而无籽沙糖桔的三个无性代都没有该条带。说明无籽沙糖桔与有籽沙糖桔在基因组DNA水平上存在差异,无籽沙糖桔三个无性代间(Vi、V2和V3)的遗传较稳定。