近年来肺癌已成为我国首位恶性肿瘤死亡原因。尽管过去的二十年在诊断技术、患者管理和细胞毒性药物治疗等方面取得了很大的发展,但令人遗憾的是,患者总的5年生存率并没有明显的提高,仅为10％左右,即使在完全切除的PN0期非小细胞肺癌(NSCLC)患者平均5年生存率也仅有70％,30％的患者有肿瘤复发,这说明手术前就已有微小隐性转移的存在。因此如何控制转移,已成为近年来肺癌乃至所有实体瘤研究的热点问题。深入研究肿瘤转移机制,寻找可以预防或抑制恶性肿瘤转移的药物,对于改善患者预后,提高肿瘤患者的生存期具有重要意义。　　 血瘀证和活血化瘀治则是近几十年来中医学界最受关注的研究热点。大部分肿瘤患者中存在有形肿块,固定不移,疼痛昼轻夜重,舌质青紫,舌体瘀点瘀斑,舌下脉络迂曲等症状,这符合中医血瘀证的表现。肺癌患者也同样存在血瘀证。因此,按传统中医理论应用活血化瘀药物治疗对肿瘤患者应当是有益的。然而在不少的文献报道中却存在着不同的结论:一些学者的研究表明活血化瘀药物可以抑制肿瘤的增殖和转移；另一些学者则认为活血药能促进肿瘤的转移；还有研究认为活血药对肿瘤细胞的侵袭和转移可能既有抑制作用又有促进作用。出现这些不同结论的原因可能是多方面的,活血中药有行气活血、养血活血、破血逐瘀、活血止血等不同种类,每种活血中药的成分又极为复杂,因此活血化瘀疗法的机制也必然是极为复杂的,由此我们推测活血药可能在某些环节上能抑制肿瘤细胞的转移,在另一些环节上则能促进肿瘤细胞的转移。　　 低氧和低PH值肿瘤组织微环境的一个重要特征,是肿瘤转移的土壤,缺氧诱导因子(hypoxiainduciblefactor,HIF)是细胞为适应缺氧环境而表达的一种蛋白,HIF-1α介导血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的活化,促进新生血管生成来改善组织缺氧状态。细胞粘附分子是细胞表达的一大类表面抗原,在肿瘤细胞的侵袭转移过程中扮演着重要的角色。血瘀证本质就包含着组织缺氧的病理改变,因此血瘀证和肿瘤组织微环境缺氧有着内在的联系。据此推测血瘀证和HIF-1α及细胞粘附分子表达异常有着一定的关系,活血药可能通过改善血瘀状态纠正上述蛋白质分子表达的异常干预肿瘤细胞转移过程。　　 本研究就是基于上述观点,为明确活血药川芎嗪在不同氧浓度环境中对人巨细胞肺癌细胞侵袭转移能力的影响,为临床医生对肺癌患者能否使用活血化瘀药物川芎嗪提供科学依据。　　 研究方法　　 建立常氧(5％CO2、95％空气)和低氧(5％O2、5％CO2、90％N2)人巨细胞肺癌细胞生长、粘附、侵袭模型,以不同浓度的川芎嗪进行干预,同时设空白对照和顺铂对照。利用流式细胞术、免疫细胞化学技术检测活血药川芎嗪对常氧和低氧PG细胞HIF-1α、CD44s、CD44v6、E-Cad及β1整合素表达情况的影响。利用浸润小室(transwell)模型研究活血药川芎嗪对常氧和低氧PG细胞粘附和侵袭的影响。　　 研究结果　　 1通过MTT酶标分析发现,川芎嗪在常氧和低氧条件下对PG细胞的体外增殖均没有影响,既无抑制作用也无促进作用。2μg／ml的DDP在常氧环境和低氧环境作用48h、72h对PG细胞的增殖有抑制作用。作用48h后顺铂对常氧和低氧PG细胞增殖的抑制强度没有差异。作用72小时后,顺铂在低氧环境中对PG细胞的抑制作用弱于常氧环境。低氧环境下各个时间点PG细胞的增殖速度均低于常氧环境,随着时间的延长,PG细胞增殖增多。　　 2利用流式细胞术检测CD324的表达,PG细胞在常氧微环境和低氧微环境中的表达阳性率不同,常氧组表达阳性率大于低氧组,两者的差异有统计学意义(P=0.006)。川芎嗪和顺铂在常氧和低氧环境中均能上调PG细胞CD324的表达,其作用强度在两种不同的环境中没有差别。　　 3利用流式细胞术检测CD29的表达,PG细胞在常氧微环境和低氧微环境中的表达阳性率没有差异(P=0.072),常氧组CD29表达的平均荧光强度低于低氧组(P<0.0001)；川芎嗪和顺铂对PG细胞在两种环境中CD29的表达均没有影响。　　 4免疫细胞化学检测HIF-1α表达,PG细胞在低氧环境中HIF-1α的表达明显高于常氧环境(P<0.0001)；在常氧和低氧环境中,各试验组PG细胞HIF-1α表达的IOD值(累积光密度)均明显低于空白对照组(P<0.0001)。TMP高、中、低浓度组和DDP组与对照组相比,HIF-1α表达的IOD值在常氧环境中分别减少了3372、2575.82、2034.79、2583.66；在低氧环境中分别减少了7385.57、7258.88、6805.07、6577.71。两因素析因设计方差分析表明药物和氧浓度之间存在交互作用(P<0.0001),因此可以推断,川芎嗪和顺铂在低氧环境中对HIF-1α表达的抑制作用更强。　　 5免疫细胞化学检测CD44s表达,PG细胞在低氧环境中CD44s的表达明显低于常氧环境(P<0.0001)；在常氧和低氧环境中,各试验组PG细胞CD44s表达的IOD值(累积光密度)均明显低于空白对照组(P<0.0001)。TMP高、中、低浓度组和DDP组与对照组相比,CD44s表达的IOD值在常氧环境中分别减少了30204.88、27229.19、29023.94、19283.26；在低氧环境中分别减少了4247.90、3723.66、2725.21、4689.77。两因素析因设计方差分析表明药物和氧浓度之间存在交互作用(P<0.0001),因此可以推断,川芎嗪和顺铂在常氧环境中对CD44s表达的抑制作用更强。　　 6免疫细胞化学检测CD44v6表达,PG细胞在低氧环境中CD44v6的表达明显低于常氧环境(P<0.0001)；在常氧和低氧环境中,各试验组PG细胞CD44v6表达的IOD值(累积光密度)均明显低于空白对照组(P<0.0001)。TMP高、中、低浓度组和DDP组与对照组相比,CD44v6表达的IOD值在常氧环境中分别减少了15937.31、21819.92、21052.21、31481.72；在低氧环境中分别减少了10387.72、14353.89、12755.27、22412.32。两因素析因设计方差分析表明药物和氧浓度之间存在交互作用(P=0.001),因此可以推断,川芎嗪和顺铂在常氧环境中对CD44v6表达的抑制作用更强。　　 7用MTT法观察PG细胞对重建基底膜的粘附作用,PG细胞在常氧环境中对基底膜的粘附能力强于低氧环境,常氧组平均吸光度大于低氧组(P<0.0001)。在常氧和低氧微环境中高、中、低浓度的川芎嗪及顺铂对PG细胞的粘附均有促进作用。低氧环境中TMP高、中、低浓度组和DDP组对PG细胞粘附的促进率均大于常氧环境(P<0.0001)。　　 8利用Transwell小室观察PG细胞在对重建基底膜的侵袭作用,PG细胞在常氧环境中的侵袭能力强于低氧环境(P<0.0001)。在常氧和低氧微环境中高、中、低浓度的川芎嗪及顺铂对PG细胞的侵袭能力均有抑制作用。川芎嗪和顺铂在不同氧环境中对PG细胞侵袭能力的抑制作用没有差异(P=0.114)。　　 讨论　　 1综合上述结果,我们认为低氧浓度环境对PG细胞在转移不同环节的影响不同。既有有利于转移行为的改变,包括CD324.表达的下调,CD29和HIF—1α表达的上调以及粘附能力的减弱；也有能够抑制转移行为的改变,包括CD44s和CD44v6表达的下调以及侵袭能力的减弱。川芎嗪对其转移能力的影响在不同的环节也不同,在对基底膜的粘附实验中,川芎嗪表现出促进粘附的作用,这一点可能有利于PG细胞在脉管和靶器官的着床,有利于其转移；而在其他环节,川芎嗪对PG细胞的转移能力则有明显的抑制作用。最终是促进还是抑制转移,还要看各个环节综合作用的结果。　　 2本研究的创新点　　 关于活血化瘀药物对于乏氧微环境下肺癌细胞粘附、侵袭能力的影响及其作用机理的研究,目前国内外未见相关报道,是本研究的创新之处。　　 3存在问题与展望　　 3.1本研究明确了人巨细胞肺癌细胞(PG)在低氧和常氧环境中的生物学特性及活血药川芎嗪对其影响有差异,但是缺氧程度的不同对其影响是否存在差异,是本研究的未尽之处。　　 3.2关于肿瘤细胞粘附能力强弱对其转移能力的意义,传统的观点认为肿瘤细胞对胞外基质粘附的减弱是其转移的有利因素,而本实验的结果显示,在低氧条件下,PG细胞对基底膜的粘附明显低于氧其在常氧条件下对基底膜的粘附,但是其对基底膜的侵袭能力在低氧条件下也是减弱的,并没有相应增强,那么粘附能力的改变在肿瘤细胞由原发灶向靶器官迁移的不同阶段意义是否不同,有待于在以后的研究中予以明确。　　 3.3在现有的文献报道中,缺氧会导致细胞粘附分子向有利于肿瘤细胞侵袭转移的方面转变,而本研究结果显示:虽然在低氧条件下PG细胞CD324的表达下调,HIF-1α的表达上调是有利于肿瘤细胞侵袭转移的,但是在低氧条件下,PG细胞CD44s、CD44v6的表达与其在常氧条件下的表达相比却是明显下调的,这种变化是不利于PG细胞的侵袭转移的,这与Transwell小室侵袭实验的结果是相符的。因此,在以后的研究中应该进一步探索低氧条件下与肿瘤转移相关的其它因素的变化,进一步明确缺氧对肿瘤转移的影响。