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目的:肾细胞癌(RCC)是一种泌尿系统恶性肿瘤,成人发病率为2%-3%,并在近年来呈现升高趋势,患者死亡率高。由于缺乏明显的早期症状,现有检测技术尚不能满足早期诊断的要求,病情易被延误。因此研究并建立新的检测技术方法,对肾细胞癌的早期诊断、治疗和预后具有重要的临床价值。生物传感器作为一类快速、精准和超灵敏分析元件,近年来已成为生物医学分析领域的关注热点,特别是以活细胞作为敏感元件的细胞传感器,更是受到了临床诊断研究者们的青睐。 已有研究表明,细胞表面的唾液酸(SA)分子表达量的变化与恶性肿瘤的发生发展紧密相关,可作为一种肿瘤标志物。当恶性肿瘤发生时,唾液酸分子表达显著增多,细胞粘附性降低,有利于癌细胞进入血液或者尿液中。因此,基于细胞传感器的良好生物相容性、超灵敏性、高特异性和稳定性以及SA标志物,本研究将利用肾癌细胞表面特异唾液酸分子,以聚吡咯(PPy)和银亚微颗粒复合物(Ag@BSA)为信号放大材料,3-氨基苯硼酸(APBA)为分子探针,拟构建一种新型细胞传感技术用于肾癌细胞的检测。 方法:①利用银粒子的导电性和牛血清白蛋白(BSA)的功能性,制备Ag@BSA亚微颗粒,通过电子显微镜(SEM和TEM)、傅立叶红外光谱(FT-IR)和能量衍射电子光谱(EDS)对合成的材料进行表征,同时利用CCK-8试验考察Ag@BSA的细胞毒性;② PPy具有较大的比表面积和良好的导电性,通过循环伏安法将其与Ag@BSA亚微颗粒一步共沉积到金电极表面,形成的PPy-Ag@BSA复合膜。利用扫描电镜、三维激光扫描和循环伏安法验证PPy-Ag@BSA复合膜是否共沉积成功;③差分脉冲伏安法(DPV)和电化学交流阻抗(EIS)对细胞传感器构建过程进行表征;④循环伏安法对 PPy- Ag@BSA复合膜共沉积循环数、APBA固定孵育时间和捕获细胞时间优化,以提高传感器的特异性和灵敏度;⑤用构建的传感器对不同浓度的肾癌细胞系786-O进行检测,通过电化学阻抗谱进行表征得到传感器的检测范围与检测限;⑥电化学阻抗谱验证细胞传感器的特异性、稳定性和重现性;⑦利用构建的细胞传感器检测临床肾癌病人的尿液标本。 结果:电镜分析、FT-IR和EDS表征结果均证明Ag@BSA的成功合成,同时 CCK-8试验表明 Ag@BSA具有良好的生物相容性。扫描电镜、三维激光扫描和循环伏安法结果显示PPy-Ag@BSA成功沉积在金电极表面,增大了电极表面积和导电性,表明首次成功合成PPy-Ag@BSA复合物。电化学方法验证传感器构建成功后,条件优化结果显示PPy-Ag@BSA共沉积循环数为15圈,APBA固定孵育时间为60 min,细胞和APBA结合时间为60 min。最佳实验条件下,传感器检测范围为17~1.7×106细胞/mL,最低检测限为(S/N=3)6细胞/mL,传感器显示了良好的特异性、稳定性和重现性。3例临床肾癌病人检测结果显示该传感器可快速特异识别尿液标本中的肾癌细胞,初步表明其具有潜在的重要临床应用价值。 结论:本课题利用PPy-Ag@BSA复合物及APBA与唾液酸的特异性连接作用成功构建了阻抗型细胞传感器。该传感器检测限低、灵敏度高和稳定性好,可用于尿液中肾癌细胞的检测。研究为肾细胞癌的早期诊断临床应用提供了科学依据。