体外培养的原代肝细胞被广泛用于药物代谢、药物间相互作用和药物肝毒性的研究。传统的单层贴壁培养不能长期保持肝细胞功能和细胞色素酶活性,这些限制了它在药物研究中的应用。本论文将生物人工肝微型化,采用拟组织化的凝胶包埋大鼠肝细胞培养方式,从药物代谢、药物间相互作用和药物肝毒性方面研究其可行性。为了使较难获得的肝细胞充分应用于研究中,肝细胞的低温长期保存非常重要。本实验还试图寻找一种简单的方法低温冻存新鲜分离的大鼠肝细胞,并研究解冻后肝细胞的功能。本论文主要分以下四部分: 第一部分研究了凝胶包埋培养大鼠肝细胞应用于药物代谢的可行性。实验以非那西丁、对硝基苯酚和7-羟基香豆素作为底物,研究了CYP1A2、CYP2E1和Ⅱ相酶(葡萄糖转移酶和硫酸转移酶)的活性。结果发现单层贴壁培养的肝细胞酶活性下降很快,凝胶包埋培养的肝细胞在7天内能保持较高的Ⅰ相和Ⅱ相酶的活性,而且活细胞代谢酶活性比单层贴壁高1.5倍左右。以上结果表明凝胶包埋比单层贴壁培养能更好地保持药物代谢酶的活性。 第二部分评价了凝胶包埋培养大鼠肝细胞用于药物间相互作用研究的可行性。实验以β-萘黄酮(50μmol/L)作为诱导剂,研究它对肝细胞CYP1A2、葡萄糖转移酶和硫酸转移酶的诱导作用,发现经过β-萘黄酮诱导后,凝胶包埋和单层贴壁培养的肝细胞CYP1A2的活性增强2.5倍左右,而Ⅱ相酶的活性增加并不明显。另外,以二乙基二硫氨甲酸(5μmol/L)、西咪替丁(1mmol/L)作为抑制剂,研究它们对CYP2E1的抑制作用,发现两种抑制剂对两种培养模型的肝细胞都有明显的抑制作用。上述结果显示凝胶包埋培养的肝细胞适合用于药物与药物间相互作用的研究。 第三部分讨论了凝胶包埋培养大鼠肝细胞用于药物肝毒性研究的可行性。实验研究了水杨酸钠(1,5mmol/L)对凝胶包埋和单层贴壁培养的肝细胞的毒性作用,结果显示水杨酸钠对凝胶包埋和单层贴壁培养的大鼠肝细胞同样具有毒性作用。实验还用甲氨喋呤(1,5mmol/L)考察了凝胶包埋长期培养毒性的研究,发现凝胶包埋对甲氨喋呤的毒性不敏感。这可能是由于凝胶包埋能较好地保持酶活性和肝功能,增强了细胞的修复功能而导致毒性不明显。 第四部分研究了大鼠肝细胞的冷冻方法及肝细胞解冻后的肝功能。实验采用