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目的:丝裂原活化蛋白激酶家族(Mitogen-activated protein kinase, MAPKs)是细胞内广泛存在的一类含丝氨酸/苏氨酸残基的蛋白激酶,介导细胞生长、发育、分裂、凋亡等多种生理过程。p38 MAPK是MAPKs家族的一个亚型,大量研究发现,p38 MAPK信号传导通路与脑缺血损伤及脑缺血耐受诱导有着密切联系。我们既往的研究结果表明,在体脑缺血预处理通过引起星形胶质细胞谷氨酸转运体-1 ( glial glutamate transporter-1, GLT-1)大量表达而诱导脑缺血耐受,但脑缺血预处理引起GLT-1大量表达的机制目前尚不清楚。脑缺血预处理是否通过p38 MAPK信号转导通路诱导GLT-1大量表达而发挥脑保护作用目前尚未见相关报道。因此,本实验旨在观察脑缺血耐受诱导过程中,p38 MAPK激酶对大鼠海马CA1区谷氨酸转运体GLT-1蛋白表达的影响,探讨脑缺血预处理是否通过p38 MAPK通路诱导GLT-1蛋白大量表达而发挥保护作用,从而为将来脑缺血性疾病的防治提供理论依据。方法:健康雄性Wistar大鼠(280～320g)300只,随机分为以下三部分:1脑缺血预处理对p-p38 MAPK蛋白及GLT-1蛋白表达的影响除control组之外,其余大鼠均首先永久凝闭椎动脉,恢复2天后,进行假手术或脑缺血处理,具体分组如下:①control组(n=5);②sham组(n=45):只暴露双侧颈总动脉,不阻断血流;③脑缺血预处理(cerebral ischemic preconditioning, CIP)组(n=45):夹闭双侧颈总动脉3 min,然后恢复血流再灌注;④损伤性缺血(ischemic insult, II)组(n=45):夹闭双侧颈总动脉8 min,然后恢复血流再灌注;⑤CIP+II组(n=45):夹闭双侧颈总动脉3 min作为脑缺血预处理,再灌2天后,再次夹闭双侧颈总动脉8 min作为损伤性缺血,然后恢复再灌注。除control组之外的其余各组,又分为9个时间点,即假手术或末次缺血后0 min、15 min、30 min、3 h、6 h、1 d、2 d、4 d、7 d(每个时间点n=5)。在规定的时间点,断头取海马脑组织,硫堇染色进行神经病理学评价;应用Western blot法观察p-p38 MAPK蛋白及GLT-1蛋白的表达。2 p38 MAPK的特异性抑制剂SB203580对脑缺血耐受诱导的影响具体分组如下:①sham组(n=5);②CIP组(n=5);③II组(n=5);④CIP+II组(n=5);⑤SB203580+sham组(n=15):暴露颈动脉前30分钟右侧脑室注射p38 MAPK特异性抑制剂SB203580,其余步骤同sham组;⑥3% DMSO+CIP+II组(n=5);暴露颈动脉前30分钟右侧脑室注射3%DMSO 20μl,其余步骤同CIP+II组;⑦SB203580+CIP+II组(n=15):脑缺血预处理前30分钟右侧脑室注射SB203580,其余步骤同CIP+II组。其中,⑤、⑥、⑦组根据SB203580剂量不同,又分成1.25 nmol、2.5 nmol、5n mol 3个亚组,每个亚组n=5。末次缺血或假手术后7天取材,应用硫堇染色观察海马CA1区病理学分级和神经元密度,探讨p38 MAPK的特异性抑制剂SB203580对脑缺血耐受诱导的影响。3 p38 MAPK的特异性抑制剂SB203580对脑缺血耐受诱导过程中GLT-1蛋白表达的影响具体分组如下:①3% DMSO+CIP+II组(n=30);②SB203580+CIP+II(n=60)。根据设计,脑缺血预处理前30分钟侧脑室注射3% DMSO或SB203580,然后夹闭双侧颈总动脉3 min作为脑缺血预处理,再灌2天后,再次夹闭双侧颈总动脉8 min作为损伤性缺血,而后恢复再灌注。根据SB203580剂量不同,又分成2.5 nmol、5 nmol两个亚组,每个亚组n=30。于末次缺血后即刻(0 min)、3 h、6 h、1 d、4 d、7 d时取海马脑组织(每个时间点n=5),应用western blot法观察GLT-1蛋白的表达,探讨抑制p38 MAPK信号转导通路对GLT-1蛋白表达的影响。结果:1在脑缺血耐受诱导过程中,大鼠海马CA1区p-p38 MAPK蛋白和GLT-1蛋白的表达及其时间对比Western blot分析显示,control组大鼠海马CA1区有一定量的GLT-1蛋白的基础表达。但control组大鼠海马CA1区p-p38MAPK蛋白的基础表达极低。与control组相比,sham组GLT-1的表达在各时间点均有所上调,IOD比值在各时间点均明显升高(P<0.01),以3 h最为显著。与control组相比,sham组p-p38 MAPK的表达在各时间点均有所上调,15 min时间点上调最明显(P<0.01)。CIP组各时间点GLT-1的表达较control组相比均上调(P<0.01);但与即刻取材时间点相比,GLT-1的表达从3 h时间点后开始明显升高,以6 h、1 d时间点较明显(P<0.05)。CIP组各时间点p-p38 MAPK的表达较control组相比均上调(P<0.01);但与即刻取材时间点相比,p-p38 MAPK的表达在15 min时间点就明显上调(P<0.05),但以3 h时间点达到高峰,并持续到1 d左右,2 d后p-p38 MAPK的表达有所降低(P<0.05)。由此可见,CIP引起了p-p38 MAPK的表达和GLT-1表达的不同步上调,p-p38 MAPK的上调早于GLT-1表达的上调。II组与即刻取材时间点相比, GLT-1蛋白的表达在15 min、30 min时间点无明显变化(P>0.05),从3 h时间点开始降低,随着时间的推移逐渐降低,以4 d、7 d时间点最明显(P<0.01)。全脑缺血8 min后大鼠海马CA1区p-p38 MAPK的表达明显增高,其增高表现为双峰状,与即刻时间点相比,第一次高峰发生于缺血后15 min,3 h时间点与即刻时间点相比无显著差异(P>0.05)。第二次高峰从缺血后6 h开始逐步升高,到4 d时达到其峰值,7 d时依然很高(P<0.01)。上述结果表明,全脑缺血8 min后,p-p38 MAPK的表达变化早于GLT-1蛋白的表达;但p-p38 MAPK的表达明显上调,而GLT-1蛋白的表达明显下调。CIP+II组与control组相比,GLT-1的表达在即刻时间点明显上调(P<0.01);与即刻取材时间点相比,在6 h时间点明显升高(P<0.01),其余时间点无明显差异(P>0.05)。p-p38MAPK的western blot分析显示,p-p38MAPK在早期即0 min、15 min、30 min、3 h时间点表达非常明显(P<0.01),6 h后表达明显降低(P<0.01)。上述结果表明,提前2天进行的3min缺血预处理,阻断了其后2 d进行的8 min全脑缺血所引起的p-p38 MAPK的过度表达上调和GLT-1明显下调。2 p38 MAPK的特异性抑制剂SB203580剂量依赖性地阻断脑缺血预处理所诱导的脑缺血耐受硫堇染色显示,sham组大鼠海马CA1区锥体细胞排列整齐、致密,为2～3层,无细胞缺失,细胞形态完整,胞核饱满,核仁深染、清晰。HG分级为0级,ND值为203±5.32(cells/mm,下同)。CIP组大鼠在各时间点海马CA1区锥体神经元均未见明显损伤,与sham组相比,HG、ND均无明显差异(P>0.05)。II组大鼠在2天内未见CA1区明显的锥体神经元损伤;7 d时,细胞形态发生明显改变,几乎全部神经元死亡或缺失,ND值为17±8.06,与sham组相比,HG明显升高(P<0.01),ND明显降低(P<0.01)。CIP+II组大鼠在各时间点海马CA1区锥体细胞排列整齐,胞核饱满,核仁较清晰,仅个别锥体细胞胞核固缩,无明显细胞缺失,7 d时与II组的相应时间点相比,HG明显降低(P<0.01),ND值为180±11.67、明显升高(P<0.01)。SB203580+sham组,无论是1.25 nmol、2.5 nmol还是5 nmol剂量组,其HG和ND与sham组相比均无明显差异(P>0.05)。3% DMSO+CIP+II组的大鼠海马CA1区锥体神经元排列整齐,形态完整,未见损伤。与CIP+II组相比,HG、ND(189±11.03)均无显著差别(P>0.05)。SB203580+CIP+II组中,随着用药剂量的加大可见海马CA1区神经元损伤加重:1.25 nmol组可见神经元排列较稀疏,有少量锥体细胞出现形态不规则,核质浓染现象,其HG与3%DMSO+CIP+II组比较无明显差异(P>0.05),但ND略有下降(P<0.05);2.5 nmol组可见CA1区的锥体神经元发生明显改变(P<0.01),大量神经元死亡或缺失,其HG与3% DMSO+CIP+II组、及1.25nmol组相比较均明显升高(P<0.01),ND均明显下降(60±10.04);5 nmol组显示海马CA1区的神经元几乎全部死亡,其HG与3% DMSO+CIP+II组比较明显升高(P<0.01),ND(15±7.23)明显下降,与2.5 nmol组比较HG进一步升高、ND进一步降低(P<0.05)。上述结果表明SB203580可以剂量依赖性地阻断脑缺血预处理所诱导的脑缺血耐受。3 p38 MAPK的特异性抑制剂SB203580对脑缺血耐受诱导过程中GLT-1蛋白表达的影响3%DMSO+CIP+II组中在0 min、3 h、6 h、1 d、4 d、7 d共6个时间点GLT-1的表达均较高。与3% DMSO+CIP+II组各个相应时间点相比,2.5 nmol SB203580+CIP+II组、5 nmol SB203580+CIP+II组两个浓度分别作用下GLT-1蛋白的表达在各个时间点均显著降低(P<0.01)。小结:1缺血预处理引起p-p38 MAPK的表达和GLT-1表达的不同步上调,且p-p38 MAPK的上调早于GLT-1表达的上调。2缺血打击后,p-p38 MAPK的表达变化早于GLT-1蛋白的表达;但p-p38 MAPK的表达明显上调,而GLT-1蛋白的表达明显下调。3提前2天进行的3 min缺血预处理,阻断了其后2 d进行的8 min全脑缺血所引起的p-p38 MAPK的过度表达上调和GLT-1明显下调。4 SB203580剂量依赖性地阻断脑缺血预处理所诱导的脑缺血耐受。5 SB203580阻断了CIP所诱导的GLT-1表达上调。结论:脑缺血预处理通过上调p-p38 MAPK的表达而引起GLT-1表达上调从而诱导脑缺血耐受。