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目前,在Booroola Merino羊及Inverdale羊和Hanna羊中已找到影响排卵数的主基因,但这些基因的精确定位及其在其它品种羊中的遗传学作用尚未见报道,因此还需要更深入的探讨多胎性状的遗传机制。本研究以济宁青山羊为主要研究对象,同时对莎能奶山羊、关中奶山羊、南江黄羊、布尔山羊和黄淮山羊共六个品种山羊以BMPR-IB基因、BMP15基因、GDF9基因、FSHR基因和ESR基因作为多胎性状的候选基因,采用限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)技术和单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism,SSCP)技术进行多态性检测,对发现的多态位点进行测序和序列分析,确定突变类型,并将各多态位点与山羊的产羔性状进行关联分析。同时采用半定量RT-PCR技术研究GDF9基因、FSHR基因和ESR基因在卵巢组织中的表达量。结果如下:1.以BMPR-IB基因和BMP15基因作为山羊多胎性状的候选基因,采用PCR-RFLP技术对BMPR-IB基因的FecB位点,BMP15基因的FecXI、FecXH、FecXG和FecXB位点从分子水平上对山羊的多胎机制进行研究。试验结果表明,BMPR-IB基因和BMP15基因在六个品种山羊不存在相应的突变,因而排除了BMPR-IB突变和BMP15基因四个位点的突变影响山羊产羔数的可能性。2.以GDF9基因作为山羊多胎性状的候选基因,采用PCR-RFLP技术和PCR-SSCP技术对GDF9基因FecGH位点、外显子1和外显子2部分序列从分子水平上对山羊的多胎机制进行研究。试验结果表明,GDF9基因FecGH位点在山羊不存在相应的突变,所检测的外显子1部分序列也没有表现出多态,因而排除了GDF9基因FecGH位点和所检测的外显子1部分序列影响六个品种山羊产羔数的可能性。对GDF9基因外显子2部分序列进行PCR-SSCP分析发现多态,AA基因型在多胎品种济宁青山羊群体内为优势基因型,A等位基因频率为0.9192,B等位基因频率为0.0808;AA基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比AB基因型的多0.67只(P<0.05),比BB基因型的多0.71只(P<0.05)。测序结果表明GDF9基因外显子2第814bp处有1个G→A的单碱基突变,该突变导致第272位氨基酸由缬氨酸改变为异亮氨酸。说明GDF9基因是控制济宁青山羊多胎性状的主效基因之一或是与之存在紧密遗传连锁关系的分子标记。3.以FSHR基因作为山羊多胎性能的候选基因,采用PCR-RFLP技术对FSHR基因5′端侧翼和部分第1外显子序列进行PstI、HaeIII、TaqI和SinI四种限制性内切酶酶切,试验结果表明六个品种山羊FSHR基因5′端侧翼和部分第1外显子序列在这四种内切酶的切点上不存在多态;对FSHR基因外显子10部分序列进行SSCP检测,结果表明,所测FSHR基因外显子10部分序列在六个品种山羊存在多态,表现两种基因型,EE基因型在多胎品种济宁青山羊群体内为优势基因型,E等位基因频率为0.8308,F等位基因频率为0.1692;FF基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比EE基因型的多0.81只(P<0.05)。测序结果表明FSHR基因外显子10第120bp处有1个C→T的单碱基突变,该突变没有导致氨基酸的改变。说明FSHR基因是控制济宁青山羊多胎性状的主效基因之一或是与之存在紧密遗传连锁关系的分子标记。4.测定的济宁青山羊FSHR基因外显子10部分序列长度为733bp,包括3′端不翻译序列37bp;其余696bp属于编码受体胞内域和部分跨膜域的第10外显子。将测定的济宁青山羊FSHR基因第10外显子的733bp序列上传到NCBI网站运用BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)进行同源性比对分析。济宁青山羊和Yarney等发表的绵羊序列之间同源性的比较结果:两者之间出现11个碱碱基变异,其中1567和1568位在Yarney等发表的序列为C和G,济宁青山羊变为G和C,结果导致编码肽链的组氨酸的密码CAC变为谷氨酰胺密码CAG,编码肽链缬氨酸的密码GTC变为亮氨酸密码CTC。其它9个碱基变异均为同义突变,都没有改变氨基酸的种类。和Yarney等发表的绵羊FSHR基因cDNA该同源区段序列相比,两者的长度一致,没有序列的插入或缺失,序列的同源性为98.50%。5.对ESR基因外显子1部分序列进行PCR-SSCP分析发现多态,C等位基因在多胎品种济宁青山羊群体内为优势等位基因,C等位基因频率为0.6039,D等位基因频率为0.3961;CC基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比CD基因型的多0.66只(P< 0.05),比DD基因型的多0.78只(P<0.05)。测序结果表明ESR基因外显子1第539bp处有1个G→C的单碱基突变,该突变没有导致氨基酸的改变。说明ESR基因也是控制济宁青山羊多胎性状的主效基因之一或是与之存在紧密遗传连锁关系的分子标记。6.采用半定量RT-PCR技术研究济宁青山羊不同GDF9基因型、不同FSHR基因型和不同ESR基因型与其发情期卵巢mRNA表达量的关系。结果显示:在发情期AA型两侧卵巢GDF9的mRNA水平(0.85±0.07,0.82±0.02)显著高于BB(0.31±0.09,0.27±0.04)和AB(0.19±0.04,0.23±0.05)型(P<0.01);在发情期FF型右侧卵巢FSHR的mRNA水平(1.26±0.09)显著高于EE(0.53±0.07)型(P<0.01),但左侧卵巢在基因型间无差异;在发情期两侧卵巢ESR的mRNA水平在基因型间无显著差异,这表明发情期GDF9和FSHR的mRNA的高表达量可能是引起济宁青山羊较高的产羔数的原因之一,而ESR的mRNA的表达量可能与济宁青山羊较高的产羔数无直接关系。7.采用半定量RT-PCR技术研究发情期济宁青山羊GDF9基因型(AA,AB和BB)与FSHR和ESR卵巢mRNA表达量的关系。结果显示:在发情期AA型右侧卵巢FSHR的mRNA水平(1.15±0.09)显著高于BB (0.36±0.02)和AB (0.54±0.07)型(P<0.01),但左侧卵巢在基因型间无差异;在发情期AA型右侧和左侧卵巢ESR的mRNA水平(0.93±0.11, 0.82±0.04)极显著高于BB(0.26±0.07,0.28±0.03)(P<0.01);AA和AB(0.56±0.05, 0.53±0.04)型以及BB和AB型差异显著(P<0.05),这表明,GDF9基因对产羔数的影响与发情期FSHR和ESR的mRNA的高表达量有关。由以上结果可知,本研究所检测BMPR-IB基因和BMP15基因突变位点可能与山羊的多胎性状无紧密联系,而GDF9基因、FSHR基因和ESR基因可能是山羊多胎性状的主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的分子标记。