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骨骼肌的形成是一个复杂的过程,包括成肌细胞的增殖、分化和肌管的形成等,这一过程受到一系列的信号分子,如转录因子等的调节。microRNA(miRNA)是动植物中广泛存在的、物种间高度保守的、长度为22个核苷酸左右的一类单链小分子非编码的RNA,在转录或转录后水平调控基因的表达。近年来,随着对microRNA研究的深入,人们发现这类单链小分子RNA参与了骨骼肌发育的调节。Myf6是生肌调节因子MRFs(Myogenic Regulatory Factors)家族的一员,它可以识别并结合于许多肌肉发育发育相关基因的启动子区域,调控肌肉的发育。本研究鉴定了直接靶定Myf63’UTR的microRNAs,主要研究了miR-374b和miR-299对C2C12成肌细胞分化的影响,主要工作及结果如下:1.调节Myf6基因的microRNA鉴定通过在线软件预测了miR-299、miR-374b、mi R-376c、miR-377、miR-499和miR-669f是直接靶定Myf6基因的候选microRNAs。我们构建了482bp的包含有候选microRNAs结合位点的Myf63’UTR野生型和突变掉miR-299和miR-374b结合位点的Myf6 3’UTR突变型双荧光素酶报告载体。证明了miR-374b能够直接靶定Myf63’UTR并调控内源Myf6表达。2.mi R-374b在肌细胞分化中的作用利用Q-PCR分别分析了miR-374b的组织表达谱和miR-374b在成肌细胞分化过程中的表达模式。mi R-374b在2月龄C57BL6小鼠心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、脂肪、骨骼肌九个组织广泛表达;miR-374b在C2C12成肌细胞分化的第0h、24h、72h和96h呈先上升后下降的表达趋势。我们通过超表达和抑制内源miR-374b表达,研究了miR-374b在C2C12成肌细胞分化过程中的作用。结果显示,在超表达miR-374b后,分化标志基因MyoG的表达量增加,而MyoD和Myf5基因的mRNA水平变化不明显。但western blot检测发现肌球蛋白重链(MyHC)的蛋白水平明显降低,免疫荧光检测也显示细胞融合率下降;相反,转染miR-374b的抑制剂,抑制miR-374b的表达,肌球蛋白重链的蛋白水平明显升高,免疫荧光检测显示细胞融合率上升。因此,我们证实了miR-374b负向调控C2C12成肌细胞的分化。另外,细胞增殖实验显示miR-374b促进C2C12成肌细胞的增殖。miR-374b在腓肠肌(混合型肌纤维)中的表达量高于比目鱼肌(慢肌纤维)的表达量。在超表达miR-374b的C2C12细胞中,Myh7(慢肌)和Myh4(快肌)的表达量均有下降,但是Myh7的下降幅度要大于Myh4的下降幅度,说明miR-374b可以同时抑制快肌纤维和慢肌纤维的形成,但是对慢肌的抑制作用更加明显。3.miR-299在肌细胞分化中的作用同样,我们利用Q-PCR分别分析了mi R-299组织表达谱以及miR-299在成肌细胞分化过程中的表达模式。在2月龄C57BL6小鼠心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、脂肪、骨骼肌九个组织中,miR-299广泛表达;miR-299在C2C12成肌细胞分化的第0h、24h、72h和96h,表达量呈上升趋势。通过超表达和抑制内源miR-299表达实验,我们研究了miR-299在C2C12成肌细胞分化过程中的作用。结果显示,超表达miR-299后,分化标志基因MyoG,MyoD,Myf5的mRNA水平均上升;通过转染miR-299的抑制剂,分化标志基因MyoG,MyoD,Myf5的表达量显著均下降。因此,我们证实了miR-299正向调控C2C12成肌细胞的分化。本研究首次鉴定出miR-374b和mi R-299能够调控成肌细胞分化,从而进一步完善了肌肉发育的microRNA调控网络,为农业生产和肌相关疾病临床治疗提供了一定的理论基础。