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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS),俗称蓝耳病,是一种病毒性传染病,主要引起怀孕母猪发热、繁殖障碍以及仔猪呼吸道异常症状和高死亡率。猪繁殖与呼吸综合征的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。PRRSV为动脉炎病毒科的成员,病毒粒子呈球型,直径为55～60nm,是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。目前,对PRRSV的复制以及分子致病机理方面研究还不是很明晰。泛素是一类广泛存在于生物体内的小分子蛋白质,物种间保守性很强,由76个氨基酸残基组成,分子量为8KDa,在降解内源性蛋白质以及对多种细胞功能的调节方面扮演着相当重要的角色。在病毒感染的不同阶段,泛素-蛋白酶体系统也起着至关重要的作用,很多病毒都存在利用和调节宿主泛素-蛋白酶体系统的现象,PRRSV是否也存在这种现象呢?本实验对此进行了研究,以期揭示泛素-蛋白酶体系统在PRRSV增殖中的作用。主要研究内容如下：1. PRRSV感染对细胞蛋白泛素化的影响以PRRSV感染Marc-145细胞,于感染后不同时间点收样,Western Blotting检测细胞内自由泛素和多聚泛素化蛋白含量的相对变化。结果发现,PRRSV感染细胞后的24-42h期间,胞内多聚泛素化蛋白的含量急剧降低,自由泛素增多,此后,又恢复到病毒感染早期的水平。而未接毒的对照组多聚泛素化蛋白水平在整个实验过程中变化不大。结果说明PRRSV感染会影响细胞内的泛素化水平。2.26S蛋白酶体功能的抑制不利于PRRSV增殖选用3种蛋白酶体抑制剂处理Marc-145细胞并接种PRRSV,于24h后收样,用蚀斑法检测病毒滴度,结果发现抑制剂MG132和Bortezomib对PRRSV的增殖产生明显的抑制作用,而抑制剂Lactacystin的作用不明显。于是将MG132和Bortezomib以不同浓度处理细胞,在接种PRRSV后24h收样,检测病毒滴度。结果与对照相比,两种抑制剂都显著降低病毒的增殖滴度,并且抑制剂浓度越高抑制效果越明显,呈剂量依赖性。随后以2μM的MG132和1μM的Bortezomib分别处理细胞,接毒后于不同时间点收样,绘制病毒的增殖曲线,结果两种抑制剂处理后病毒的增殖曲线与对照一致,但增殖滴度均明显低于对照。这些结果充分说明,蛋白酶体抑制剂MG132和Bortezomib能显著抑制PRRSV的增殖。3.26S蛋白酶体功能的抑制阻碍PRRSV蛋白的合成分别用不同浓度的抑制剂MG132和Bortezomib处理Marc-145细胞,接种PRRSV后24h收样,Western Blotting检测PRRSV Nsp2蛋白的表达。结果发现：随着抑制剂使用剂量的增加,Nsp2的表达量不断减少,且呈剂量依赖性。随后以2μM的MG132和lμM的Bortezomib分别处理细胞,于接毒后不同时间点收样,Western Blotting检测PRRSV的Nsp2蛋白表达,结果显示,抑制剂推迟了PRRSV非结构蛋白Nsp2的表达,并且减少其表达量。4.蛋白酶体抑制剂主要在病毒增殖的中期起作用PRRSV接种Marc-145细胞后,于病毒增殖的不同阶段分别用抑制剂MG132(2μM)和Bortezomib (1μM)处理接毒细胞。40h收样后,检测PRRSV的滴度。结果发现,病毒增殖的中期(接毒后16-24h)用抑制剂处理Marc145细胞,病毒滴度下降最为明显；在病毒增殖的其他阶段(接毒后0-16h)和晚期(接毒后24-40h)用抑制剂处理病毒滴度有所下降,且越接近中期病毒滴度下降越明显。可见,在病毒增殖的中期,功能完整的蛋白酶体是病毒顺利增殖的必要条件。5.超表达泛素基因有助于PRRSV增殖Marc-145细胞转染泛素真核表达质粒pCMV-(HA-Ub)4和空载体对照,转染24h后接种PRRSV,超表达组和对照组分别用蛋白酶体抑制剂MG132(2μM)和Bortezomib (1μM)以及DMSO处理,接毒24h后收样,Western Blotting检测泛素超表达效果,蚀斑法检测病毒滴度。结果发现：与DMSO处理的对照组相比,蛋白酶体抑制剂MGl32和Bortezomib能有效抑制蛋白酶体的活性,造成泛素化蛋白在细胞内的堆积；在细胞中超表达泛素,有利于病毒的增殖。